FICS 13.310 A 92 中 华人民 共和国 公共安 全行业 标准 GA GA/T × × × × －× × × × 法庭科学 生物检材中 马钱子碱 和士的宁 检验 液相色谱和液相色谱 -质谱法 Forensic sciences —Examination methods for brucine and strychnine in biological samples —HPLC and LC -MS ×××× -××-××发布 ×××× -××-××实施 中华人民共和国公安部 发布 GA/T× × × × —× × × × I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 -2009给出的规则 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员 会（SAC/TC 179/SC 1 ）提出并归口。 本标准起草单位：公安部物证鉴定中心、最高人民检察院检查技术信息研究中心、浙江省检察院、 杭州市检察院。 本标准起草人：王朝虹、王志萍、刘勇、褚建新、蒋文慧。 GA/T× × × × —× × × × 1 法庭科学 生物检材中 马钱子碱 和士的宁检验 液相色谱和液相色谱 -质谱法 1 范围 本标准规定了 法庭科学 生物检材（血、尿、肝、肾、胃及胃内容等）中马钱子碱、士的宁的液相色 谱（ HPLC）定量检验 方法和液相色谱 -质谱（ LC-MS）定性定量 检验方法。 本标准适用于 法庭科学 生物检材中马钱子碱、士的宁的定性 分析和定量分析 。其他可疑样品中马钱 子碱、士的宁的定性分析和定量分析可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求，对生物检材进行提取、净化及浓缩，采用液相 色谱 -质谱法定性定量、 高效液相色谱法 定量，以保留时间、质谱特征离子和 相对丰度比作为定性判断 依据；以峰 面积为依据，采用外标法进行定量分析。 5 试剂和材料 5.1 试剂 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的一级水 。除非另有说明，在分析中使用的试剂均为分析纯， 试 剂包括： a) 甲醇（色谱纯）； b) 乙腈（色谱纯）； c) 0.1mol/L 盐酸溶液：移取 浓盐酸 8.3mL，加水稀释并定容至 1000mL； d) 6.0mol/L 盐酸溶液：量取浓盐酸 500mL，加水稀释并定容至 1000mL； e) 10mmol/L 碳酸氢铵溶液：称取碳 酸氢铵（ NH 4HCO 3）0.79g，加一定量水溶解稀释并定容至 1000mL； f) 10mmol/L 乙酸铵溶液：称取乙酸 铵（ CH 3COONH 4）0.77g，加一定量水溶解稀释并定容至 1000mL； g) 0.1mol/L 甲酸溶液：移取甲酸 4.6mL，加水稀释并定容至 1000mL； h) 氨水； i) 标准溶液： GA/T× × × × —× × × × 2 1） 1.0mg/mL 标准物质溶液： 根据马钱子碱 和士的宁标准物质的纯度， 各称取适量， 分别用 甲醇配制成 1.0mg/mL 的马钱子碱 和士的宁标准物质溶液。密封，置于冰箱中冷藏保存。 有效期 6个月。或采用市售标准溶液； 2） 0.1mg/mL混合标准工作溶液： 移取 1.0mg/mL 的马钱子碱 和士的宁标准物质溶液 各1.0mL 于10mL容量瓶中， 用甲醇定容至10mL，混匀，密封，置于冰箱中冷藏保存，有效期 3 个月。实验中所用 其他浓度的混合标准工作 溶液均由 1.0mg/mL 标准物质溶液用甲醇稀释 得到。 注：特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液 。 5.2 材料 材料包括 : a) 具盖离心管； b) 有机系微孔滤膜： 0.22µm； c) 固相萃取柱： Oasis® MCX固相萃取柱或 等效固相萃取柱 ，使用前依次用甲醇、水活化 。 注：Oasis® WCX 柱是 Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产 品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 6 仪器和设备 仪器和设备包括： a) 液相色谱 -质谱仪：配电喷雾离子源（ ESI）和三重四极杆质量分析器； b) 高效液相色谱仪：配二极管阵列检测器（ DAD）； c) 电子天平； d) 离心机； e) 振荡器； f) 移液器； g) 固相萃取仪； h) 浓缩器。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品提取 7.1.1.1 固相萃取 移取血液等液体 检材样品 1.0mL～2.0mL，或称取铰碎的肝脏等固体 检材样品 1.0g～2.0g于具盖离 心管中，加入 0.1mol/L 盐酸溶液 5mL，混匀， 8000r/min 以上离心 20min，取上清液转移至已活化好的 固相萃取柱中，控制流速为 1mL/min，依次用 0.1mol/L HCl 溶液 1mL和甲醇 1mL淋洗，挤干水份或离 心或真空抽固相萃取柱 2min，用氨水 /甲醇 /水（体积比 5：80：15）混合溶液 1mL洗脱，收集洗脱液 并 置于浓缩器上于 40℃下浓缩至干， 残留物用 0.1mol/L 甲酸溶液 1.0mL溶解，用有机系微孔滤膜 过滤， 作为检材样品提取液， 供仪器分析。 7.1.1.2 质控样品制备 GA/T× × × × —× × × × 3 取等量相似基质的空白样品（若无相似基质空白样品可用血液替代）两份于具盖离心管中，一份作 为空白样品，一份添加 马钱子碱 或士的宁标准物质，作为添加样品（ 添加样品浓度为 10ng/mL（g））， 与检材样品平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液 ，供仪器分析。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品实际情况进行调整： a) 色谱柱： ACQUITY UPLC BEH Shield RP 18柱（ 2.1mm×50mm ，1.7µm）或等效柱； 注： ACQUITY UPLC BEH Shield RP 18色谱柱为 Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使 用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 流动相： A：70% 乙腈，B：30% 10mmol/L 乙酸铵溶液（用氨水调 pH值至9.5）； c) 洗脱方式：等度洗脱； d) 进样量： 2µL； e) 色谱柱温度： 30℃； f) 流速：0.4mL/min 。 g) 离子源：电喷雾离子源（ ESI）； h) 扫描方式：正离子； i) 检测方式：多反应监测（ MRM）； j) 毛细管电压： 3.0kV； k) 离子源温度： 150℃； l) 雾化气流速： 1000L/h； m) 锥孔气流速： 20L/h； n) 雾化气温度： 450℃； o) MS参考条（定性、定量离子对和去簇电压（ CV）、碰撞能量（ CE））见表 1。 表1 MS参考条件 中文名称 定量离子 定性离子 去簇电压 V 碰撞能量 eV 马钱子碱 395.20＞324.10 395.20＞224.20 40 30 395.20＞324.10 40 30 士的宁 335.20＞264.10 335.20＞184.10 40 35 335.20＞264.10 40 35 7.1.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液及标准工作溶液， 按7.1.2.1分析条件进样分析。 7.2 定量分析 7.2.1 样品提取 7.2.1.1 外标-单点法 移取血液等液体样品 1.0mL～2.0mL，或称取铰碎的组织样品 1.0g～2.0g两份，按 7.1.1进行操作。 GA/T× × × × —× × × × 4 另取等量相似基质的空白样品三份，其中两份分别 添加马钱子碱、士的宁标准物质 作为添加样品 （添加样品中目标物含量应为检材 样品中目标物含量的 (100± 50)% ），另一份作为空白样品 ，与检材平 行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液，供仪器检测。 7.2.1.2 外标-标准曲线法 移取血液等液体样品 1.0mL～2.0mL，或称取铰碎的组织样品 1.0g～2.0g两份，按 7.1.1进行操作。 另取等量相似基质的空白样品六 份，其中五份分别添加马钱子碱、士的宁标准物质 ，五份添加样 品的含量分别为 1ng/mL（g）、 10ng/ mL（g）、 100ng/mL（g）、 200ng/ mL（g）、 500ng/ mL （g）），另一份