ICS 13.310 A 92 中 华人民 共和国 公共安 全行业 标准 GA GA/T × × × × －× × × × 法庭科学 生物检材中河豚毒素检验 液相色谱 -质谱法 Forensic sciences —Examination method s for tetrodotoxin in biological samples—LC-MS ×××× -×× -××发布 ×××× -×× -××实施 中华人民共和国公安部 发布 GA/T× × × × —× × × × I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 -2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会（ SAC/TC 179/SC 1 ）提出并归口。 本标准起草单位：司法鉴定科学研究 院、公安部物证鉴定中心 。 本标准主要起草人：刘伟、沈敏、卓先义、沈保华、向平 、严慧、于忠山、王芳琳 。GA/T× × × × —× × × × 1 法庭科学 生物检材中河豚毒素检验 液相色谱 -质谱法 1 范围 本标准规定了 法庭科学 生物检材 （血、尿、肝、肾、胃及 胃内容等 ）中河豚毒素的液相色谱 -质谱 （LC-MS）定性定量检验方法。 本标准适用于法庭科学生物检材中河豚毒素的定性、定量分析。 其他可疑 样品中河豚毒素 的定性、 定量分析可参照使用 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 以空白样 品和添加样品作对照，按平行操作的要求，对生物检材进行提取、净化及浓缩，采用液相 色谱 -质谱法定性定量，以保留时间、质谱特征碎片离子峰和相对丰度比作为定性判断依据；以峰面积 为依据，采用外标法进行定量分析 。 5 试剂及材料 5.1 试剂 试验用水应符合 GB/T 6682 中规定的一级水。试剂包括： a) 甲醇：色谱纯 ； b) 冰乙酸：分析纯 ； c) 浓盐酸：优级纯 ； d) 乙腈：色谱纯 ； e) 甲酸：优级纯； f) 0.1%甲酸溶液：移取 0.1mL甲酸于 100mL容量瓶中，用水定容 至100mL； g) 1%乙酸甲醇溶液：移取 1mL冰乙酸于 100mL容量瓶中，用甲醇 定容至100mL； h) 1%乙酸溶液：移取 1mL冰乙酸于 100mL容量瓶中，用水定容 至100mL； i) 流动相：乙腈 :0.1%甲酸水溶液（体积比 90:10）； GA/T× × × × —× × × × 2 j) 标准溶液： 1) 1.0mg/mL 标准物质溶液 ：根据河豚毒素标准物质的纯度，称取适量 ，用甲醇配制 1mg/mL 河豚毒素标准物质溶液，置于冰箱中冷藏保存。 有效期 6个月。或采用市售标准溶液 ； 2) 10.0µ g/mL河豚毒素 标准工作 溶液：移取 1.0mg/mL 的河豚毒素 标准物质溶液 0.1mL于 10mL容量瓶中 ，用甲醇定容至10mL，混匀，密封，置 于冰箱中冷 藏保存。有效期 3个 月。实验中所用其 他浓度的标准工作溶液 均由 1.0mg/mL 标准物质 溶液用甲醇稀释得到 。 注：特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液 。 5.2 材料 材料包括： a) 固相萃取柱 ：Oasis® MCX固相萃取柱或 等效固相萃取柱 ，使用前依次 用甲醇、水活化； 注： Oasis® MCX柱是 Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产 品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 一次性注射器 ； c) 有机系微孔滤膜： 0.22µ m； d) 具盖离心管 ； e) 具塞玻璃试管 。 6 仪器和设备 仪器和设备包 括： a) 液相色谱 -质谱仪： 配电喷雾离子源 （ESI）和三重四极杆质量分析器； b) 固相萃取仪； c) 电子天平； d) 鼓风恒温干燥箱； e) 浓缩器； f) 振荡器； g) 离心机； h) 移液器。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品提取 7.1.1.1 检材样品提取 7.1.1.1.1 血液、尿液固相萃取 移取血液等液 体检材样品 1.0mL于具盖离心管中 ，加入 1%乙酸甲醇溶液 1.5mL，振荡，13000r/min 离心 3min，取上清液转移至已活化好的固相萃取柱 中，控制上清液过柱流速为 0.5mL/min ，依次用 1mL 乙腈、 1mL甲醇、 1mL水淋洗，挤干水分或离心或真空抽固相萃取柱 2min，用 0.2mol/L 盐酸溶液 /甲 醇（体积比为 4：1）1mL洗脱，洗脱液置于浓缩器上 60C浓缩至干， 残留物用流动相 200L溶解， 用有机系微孔滤膜过滤， 作为检材样品提取液， 供仪器分析 。 GA/T× × × × —× × × × 3 7.1.1.1.2 组织固相萃取 称取铰碎组织 0.5g于具盖离心管中 ，用1%乙酸甲醇溶液 1.5mL浸泡 2h后，振荡，13000r/min 离 心3min，取上清液转移至已活化好的固相萃取柱上， 其余按照 7.1.1.1 .1操作。 7.1.1.1.3 血液、尿液 液液萃取 移取血液等液体 检材样品 1.0mL于具盖离心管中， 加入 1%乙酸甲醇溶液 1.5mL，混匀后 3500r/min 离心 10min，取上清液， 剩余检材 再加入 1%乙酸甲醇溶液 1.5mL，再次提取，合并上清液。将上清液 在60℃浓缩器中用空气流吹干， 残留物用1%乙酸溶液 0.25mL复溶，再加入 0.25mL氯仿，震荡后 13000r/min 离心 3min，取上清液供仪器分析。 7.1.1.1.4 组织液液萃取 称取铰碎组织 0.5g于具盖离心管中 ，用1%乙酸甲醇溶液 1.5mL浸泡 2h后，振荡，13000r/min 离 心3min，取上清液 ，剩余检材 再加入 1%乙酸甲醇溶液 1.5mL，其余按照 7.1.1.1 .3操作。 7.1.1.2 质控样品制备 取等量相似基质的空白样品（若无相似基质空白样品可用血液替代）两份于具盖离心管中，一份作 为空白样品，一份添加河豚毒素标准物质，使其 含量为10ng/mL (g)，作为添加样品 ，与检材样品平行操 作，得到空白样品提取液和添加样品提取液 ，供仪器分析。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件（液相色谱 -质谱条件） 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况 进行调整： a) 色谱柱： PC HILIC 柱（ 100mm2.0mm，5m）或等效色谱柱； 注： PC HILIC 是资生堂公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的 认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 流动相： A：乙腈，B：0.1%甲酸溶液； c) 洗脱方式：梯度洗脱，梯度见表 1； 表1 梯度洗脱程序 时间 min A B 0 90% 10% 0.8 90% 10% 1.2 20% 80% 2.5 20% 80% 4.0 90% 10% 10 90% 10% d) 流速： 0.2mL/min ； e) 柱温：室温 ； f) 进样量： 5L； g) 离子源：电喷雾离子源（ ESI）； h) 扫描方式：正离子； GA/T× × × × —× × × × 4 i) 检测方式 ：多反应离子监测（ MRM）； j) 离子源电压 （IS）：5500V； k) 碰撞气（CAD）、气帘气 （CUR）、雾化气 （GS1)、辅助气 （GS2）均为高纯氮气； l) 河豚毒素的 LC-MS参数见表 2。 表2 河豚毒素的 LC-MS参数 名 称 定性离子对 定量离子对 去簇电压 V 碰撞电压 eV 保留时间 min 河豚毒素 320.1 >302.1 320.1 >302.1 90 35 6.74 320.1 >284.1 40 7.1.2.2 进样 分别吸取检材、空白和 添加样品提取液，按 7.1.2.1的条件进样分析。空白血液、添加河豚毒素色 谱图参见附录 A中图 A.1、图 A.2。 7.2 定量分析 7.2.1 样品提取 移取血液等液体检材样品 1.0mL，或称取铰碎的肝脏等固体检材样品 1.0g两份，按 7.1.1进行操作。 另取等量相似基质的空白样品三份，其中两份添加河豚毒素标准物质作为添加样品（添加样品中目 标物含量应为检材样品中目标物含量的 (100± 50)%），另一份作为空白样品，与检材样品平行操作，得 到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器检测。 7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器条件 按7.1.2.1规定的条件分析。 7.2.2.2 进样 分别吸取检材、空