ICS 13.310 A 92 中 华人民 共和国 公共安 全行业 标准 GA GA/T × × × × －× × × × 法庭科学 生物检材中丁丙诺啡 检验 液相色谱 -质谱法 Forensic sciences—Examination methods for buprenorphine in biological samples—LC-MS ×××× -×× -××发布 ×××× -×× -××实施 中华人民共和国公安部 发布 GA/T× × × × —× × × × I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 -2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员 会(SAC/TC 179/SC1) 提出并归口。 本标准起草单位： 公安部物证鉴定中心 、山西医科大学法医学院 。 本标准主要起草人： 王瑞花、董颖、栾玉静、 杜鸿雁、 任昕昕、王爱华 、宋歌、董林沛、 蔚志文。 GA/T× × × × —× × × × 1 法庭科学 生物检材中丁丙诺啡检 验 液相色谱 -质谱法 1 范围 本标准规定了 法庭科学 生物检材 （血、尿、肝、肾、胃及胃内容等 ）中丁丙诺啡的液相色谱 -质谱 （LC-MS）定性定量 检验方法。 本标准适用于 法庭科学 生物检材中 丁丙诺啡 的定性分析和定量分析 。其他可疑样品中丁丙诺啡 的定 性分析和定量分析可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 1 22 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求 ，对生物检材进行提取、净化及浓缩， 采用液相 色谱 -质谱法定性定量，以保留时间 、质谱特征离子碎片峰和离子 丰度比作为定性判断依据；以峰面积 为依据，采用外标法进行定量分析。 5 试剂和材料 5.1 试剂 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的一级水， 除非另有说明，在分析中使用的试剂均为分析纯，试 剂包括： a) 甲醇（色谱纯）； b) 乙腈（色谱纯）； c) 氨水； d) 盐酸； e) 5%氨水/乙腈溶液：量取 5mL氨水，加乙腈稀释至 100 mL； f) 0.1mol/L 盐酸：量取 8.4mL浓盐酸，加水稀释至 1000m L； g) 5mmol/L 乙酸铵溶液（ pH值9.0）：称取乙酸铵 0.38g，加水溶解 并稀释至 1000mL，用氨水 调至pH值为 9.0； GA/T× × × × —× × × × 2 h) 5mmol/L 甲酸铵溶液（ pH值3.5）：称取甲酸铵 0.32g，加水溶解稀释至 1000mL，用甲酸调 pH值为 3.5； i) 标准溶液 ： 1） 1.0mg/mL 标准物质溶 液：根据丁丙诺啡标准物质纯度和盐型换算后， 称取适量， 用甲醇 配制 1.0mg/mL 丁丙诺啡标准物质溶液，置于冰 箱中冷藏保存。有效期 6个月。或采用 市售标准溶液 ； 2） 10.0µg/mL标准工作 溶液：移取 1.0mg/mL 标准物质溶液 0.1mL，用甲醇稀释至 10mL， 混匀，密封，置于冰箱中冷藏保存。有效期 3个月。实验中所用其他浓度的标准工作溶 液均由 1.0mg/mL 标准物质溶液用甲醇稀释得到。 注：特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液 。 5.2 材料 材料包括： a) 固相萃取柱 ：混合型阳离子交换（ MCX）固相萃取柱或等效固相萃取柱 ，使用前依次用甲醇、 水活化； b) 一次性注射器； c) 具盖离心管； d) 有机系微孔滤膜 ：0.22µm。 6 仪器和设备 仪器和设备包括： a) 液相色谱 -质谱仪：配 有电喷雾离子源（ ESI）和三重四极杆或离子阱质量分析器 ； b) 离心机； c) 振荡器； d) 电子天平 ； e) 移液器。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品提取 7.1.1.1 沉淀蛋白 移取血液等液体检材样品 0.5mL，或称取铰碎的肝脏等固体检材样品 0.5g于具盖离心管中。加入乙 腈2mL，振荡 10min，8000r/min 离心 20min，取上清液，经有机 系微孔滤膜过滤，作为检材样品提取液， 供仪器分析。 7.1.1.2 固相萃取 移取血液等液体检材样品 1.0mL～2.0mL，或称取绞碎的肝脏等固体检材样品 1.0g～2.0g于具盖离心 管中，用 4倍体积 0.1mol/L的盐酸稀释，振荡 10min，8000r/min 离心 20min，取上清液转移至已活化好的 MCX固相萃取柱中，控制上清液过柱流速为 0.5mL/min ，依次用 0.1mol/L盐酸 1mL、甲醇 1mL、乙腈 1mL 淋洗，抽干弃去淋洗液，挤干水分或离心或真空抽固相萃取柱 2min，用1mL 5%的氨水 /甲醇溶液洗脱，GA/T× × × × —× × × × 3 收集洗脱液 置于浓缩器上 45℃浓缩至干，残留物用甲醇 200L溶解，用0.22μm的有机系微孔滤膜过 滤， 作为检材样品提取液，供 仪器分析。 7.1.1.3 质控样品 制备 取等量相似基质的空白样品（若无相似基质空白样品可用血液替代）两份于具盖离心管中，一份作 为空白样品，一份添加丁丙诺啡标准物质，作为添加样品（添加样品的浓度为 20ng/mL） ，与检材样品 平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器检测。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件 7.1.2.1.1 液相色谱 -质谱（离子阱质量分析器） 条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器 和不同样品 实际情况进行调整： a) 色谱柱： XTerra RP18色谱柱 （2.1mm× 150mm ，3.5µm），或其他等效反相液相色谱柱； 注： XTerra® RP 18是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产 品的认可。如果其他等 效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 柱温：30℃； c) 流动相：80%乙腈 :20%5mmoL/L 乙酸铵溶液（氨水调节 pH至9.0）； d) 流速： 0.2mL/min ； e) 进样体积： 10µL； f) 离子源：电喷雾电离（ ESI）； g) 扫描方式： 正离子检测 ，采用二级全扫， 母离子 [M+H]+=468.3，定量子离子 m/z=414.2 ； h) 源电压： 4.5kV； i) 加热毛细管温度 ：280℃； j) 鞘气（氮气）流量 ：38arb，辅助气（氮气）流量 ：5arb； k) 碰撞能：34％。 7.1.2.1.2 液相色谱 -质谱（三重四级杆质量分析器）条件 以下为参考条件， 可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整 ： a) 色谱柱： ACQUITY UPLC BEH C 18柱， (2.1mm× 100 mm,1.7 µm)或其他等效 色谱柱； 注： ACQUITY UPLC BEH C 18是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标 准的使用者，并不是表 示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 流动相：A：乙腈，B：5mmol/L甲酸铵溶液（ pH值3.5）； c) 梯度洗脱 程序：见表 1； 表1 梯度洗脱条件 时间 min A B ---- 10% 90% 1.5 90% 10% 2.2 90% 10% 2.5 10% 90% 4.0 10% 90% GA/T× × × × —× × × × 4 d) 柱温：35℃； e) 流速： 0.6mL/min； f) 离子源：电喷雾电离（ ESI）； g) 检测方式：正离子； h) 毛细管电压： 3.5kV； i) 源温度：150℃； j) 雾化气流速： 800L/h； k) 锥孔气流速： 50L/h； l) 扫描模式：多反应离子监测（ MRM）； m) MS参考条件（ 定性、定量离子和锥孔电压、碰撞能 量）见表 2。 表2 MS参考条件 检测目标物 定量离子 对 定性离子 对 锥孔电压 V 碰撞能量 eV 丁丙诺啡 468.4＞414.2 468.4＞396.1 35 35 468.4＞414.2 40 7.1.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液及标准工作溶液，按 7.1.2.1的分析条件进样分析。 7.2 定量分析 7.2.1 样品提取 移取血液等液体检材样品 1.0mL～2.0mL，或称取铰碎的肝脏等固体检材样品 1.0g～2.0g两份，按 7.1.1 .2进行操作。 另取等量相似基