ICS 13.310 A 92 中 华人民 共和国 公共安 全行业 标准 GA GA/T × × × × －× × × × 法庭科学 生物检材中地西泮及其代谢物 检验 液相色谱 和液相色谱 -质谱法 Forensic science s—Examination methods for diazepam and its metabolites in biological samples —LC and LC -MS × × × × -×××× -×× -××实施 中华人民共和国公安部 发布 ×××× -×× -××发布 GA/T × × × × —× × × × I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。 本标准由全国 刑事技术 标准化技术委员会 毒物分析分技术委员会 （SAC/TC 179/SC 1）提出并归口。 本标准起草单位： 山西医科大学 、公安部物证鉴定中心 、中国人民公安大学 。 本标准主要起草人： 贠克明、何毅、崔冠峰、尉志文、任昕昕、王玉瑾、何洪源 、王乐乐 、何文婷 。 GA/T × × × × —× × × × 1 法庭科学 生物检材中地西泮及其代谢物 检验 液相色谱和液相色谱 -质谱法 1 范围 本标准规定了 法庭科学 生物检材（血、尿、肝、肾、胃及胃内容等 ）中地西泮 及其代谢物 （去甲西 泮、去甲羟基西泮、 去甲羟基西泮葡萄糖醛酸苷、羟基 西泮葡萄糖醛酸苷 ）的高效液相色谱 （HPLC） 及液相色谱 -串联质谱（LC-MS/MS）定性定量 检验方法 。 本标准适用于 法庭科学 生物检材中地西泮及其代谢物 （去甲西泮、去甲羟基西泮、去甲羟基西泮葡 萄糖醛酸苷、羟基西泮葡萄糖醛酸苷） 的定性分析和定量分析。其他可疑样品中地西泮及其代谢物的定 性分析和定量分析可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件对本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本 文件。 4 原理 以空白样品和添加样品 作对照，按平行操作的要求， 对生物检材 进行提取、净化及浓缩 ，采用液相 色谱 -串联质谱法定性定量 ，高效液相色谱法定量 ，以保留时间 、质谱特征离子 和离子丰度比作为定性 判断依据； 以峰面积为依据，采用外标法进行定量分析 。 5 试剂和材料 5.1 试剂 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的一级水。在分析中使用的试剂均为色谱纯，试剂包括： a) 甲醇； b) 醋酸铵； c) 氨水； d) 甲醇 /氨水 /水（体积比 5:2:93）混合溶液 ：移取甲醇 5mL、氨水 2mL，用水定容至 1000mL； e) 标准溶液： 1) 1.0mg/mL 地西泮、去甲西泮、去甲羟基西泮 标准物质溶液：根据 地西泮、去甲西泮、去 甲羟基西泮 标准物质的纯度， 各称取适量 ，分别用甲醇配制 1.0mg/mL地西泮、 去甲西泮、 去甲羟基西泮 标准物质溶液，置于冰箱中冷藏保存。有效期 6个月。或采用市售标准 溶 液； 2) 0.1mg/mL 去甲羟基西泮葡萄糖醛酸苷、羟基西泮葡萄糖醛酸苷标准物质溶液：采用市售 标准溶液； 3) 10.0µ g/mL 混合标准工作溶液：移取 1.0mg/mL 的地西泮、去甲西泮、去甲羟基西泮 标准GA/T × × × × —× × × × 2 物质溶液各 0.1mL，0.1mg/mL 去甲羟基西泮葡萄糖醛酸苷、羟基西泮葡萄糖醛酸苷标准 物质溶液各 1.0mL，用甲醇定容至 10mL，混匀，密封，置于冰箱中冷藏保存 。有效期 3 个月。实验中所用其他浓度的混合标准工作溶液均由 10.0µ g/mL 标准物质溶液用甲醇稀 释得到； 4) 10.0µ g/mL 地西泮及其代谢物单一标准工作溶液 ：移取 1.0mg/mL 的地西泮、去甲西泮、 去甲羟基西泮标准物质溶液各 0.1mL，0.1mg/mL 去甲羟基西泮葡萄糖醛酸苷、羟基西泮 葡萄糖醛酸苷标准物质溶液各 1.0mL，分别用甲醇定容至 10mL，混匀，配制成浓度为 10.0µ g/mL 的单一标准工作溶液，密封，置于冰箱中冷藏保存，有效期 3个月。实验中所 用其他浓度的 单一标准工作溶液均由 10.0µ g/mL 标准物质溶液用甲醇稀释得到 。 注：特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液 。 5.2 材料 材料包括： a) 具盖离心管 ； b) 具塞玻璃试管 ； c) 固相萃取柱： C18柱或等效固相萃 取柱，使用前依次用甲醇、去离子水 活化； d) 一次性注射器 ； e) 有机系微孔滤膜： 0.22µ m。 6 仪器和设备 仪器和设备包括： a) 高效液相色谱仪 ：配有紫外检测器 ； b) 液相色谱 -串联质谱仪：配有电喷雾离子源 （ESI）和三重四级杆质量分析器 ； c) 电子天平 ； d) 离心机； e) 振荡器； f) 移液器； g) 浓缩器。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品提取 7.1.1.1 固相萃取 移取血液等液体检材样品 1.0mL～3.0mL， 或称取铰碎的肝脏等固体检材样品 1.0g～3.0g于具盖离心 管中，加入水 3mL，振荡 15min，8000r/min离心 20min，取上清 液转移至 已活化的C18固相萃取柱 中，控 制上清液过柱 流速为 0.5mL/min ，依次用水1mL、甲醇 /氨水 /水（体积比 5:2:93）混合溶液 1mL淋洗，抽 干弃去淋洗液，挤干水分或离心或真空抽固相萃取柱 2min，用甲醇 1mL洗脱，控制流速为 0.5mL/min ， 收集洗脱液置于 浓缩器上 50℃浓缩至干，残留物用100µ L甲醇溶解，经0.22μm的有机系微孔滤膜过滤， 作为检材样品提取液 供LC-MS/MS分析。 7.1.1.2 质控样品制备 取等量相似基质的空白样品（若无相似基质空 白样品可用血液替代）两份于具盖离心管中，一份作 为空白样品，一份添加 地西泮、 去甲西泮、 去甲羟基西泮 、去甲羟基西泮葡萄糖醛酸苷 和羟基西泮葡萄GA/T × × × × —× × × × 3 糖醛酸苷 标准物质，作为添加样品（ LC-MS/MS添加样品的浓度为 10ng/mL(g) ） ，与检材样品平行操作， 得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器检测。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件 （液相色谱 -质谱条件 ） 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整： a) 色谱柱： C18柱（2.1×100mm，1.7μm）或等效色谱柱； b) 柱温：40℃； c) 流速： 0.4mL/min； d) 流动相： A：乙腈，B：0.1%甲酸水溶液； e) 洗脱：梯度洗脱，见表 1； 表1 梯度洗脱 条件 时间 min A B 0 10% 90% 0.5 10% 90% 3.8 90% 10% 4.5 90% 10% 4.7 10% 90% 5.5 10% 90% f) 离子化方式： 电喷雾离子 源（ESI）； g) 检测方式： 正离子； h) 扫描方式 ：多反应离子检测 （MRM）； i) 毛细管电压： 5.5kV； j) 辅助气温度： 550℃； k) 辅助气 1流量： 50psi， l) 辅助气 2流量：50psi； m) MS参考条件（定性、定量离子对和去簇电压 和碰撞能 ）：见表 2。 表2 MS参考条件 名 称 定性离子对 去簇电压 V 碰撞能量 eV 地西泮 285>154* 40 40 285>193 40 40 去甲西泮 271>140* 50 30 271>165 50 30 去甲羟基西泮 287>269* 45 25 287>241 45 30 羟基西泮葡萄糖醛酸酐 477>283 30 20 477>301* 30 30 去甲羟基西泮葡萄糖醛 酸酐 463>269 35 20 463>287* 35 32 注： *为定量离子 对。 7.1.2.2 进样 分别吸取检材 、空白和添加样品提取液及标准工作溶液，按 7.1.2.1的分析条件进样分析。 7.2 定量分析 7.2.1 样品提取 GA/T × × × × —× × × × 4 移取血液等液体检材样品 1.0mL～3.0mL两份， 或称取铰碎的肝脏等固体检材样品 1.0g～3.0g两份于 具盖离心管中， 按7.1.1进行操作 。 另取等量 相似基质的空白样品 三份，其中两份分别添加 地西泮、去甲西泮、去甲羟基西泮、去甲羟 基西泮葡萄糖醛酸苷和羟基西泮葡萄糖醛酸苷 标准物质作为添加样 品（添加样品中目标物含量应为检材 样品中目标物含量的 (100± 50)%） ，另一份