ICS 07.100.99 CCS B41 T/ZNZ 浙 江 省 农 产 品 质 量 安 全 学 会 团 体 标 准 T /ZNZ 080—2021 畜禽源和养殖环境中沙门氏菌的分离及药 敏试验方法 Isolation of Salmonella from livestock and p oultry sources and breeding environment and its antimicrobial susceptibility testing 2021 - 09 - 17发布 2021 - 10 - 17实施 浙江省农产品质量安全学会 发布 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 080—2021 1 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起 草。 本文件的某些内容可能涉及专利。本文件发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由浙江省农产品质量安全学会 提出并归口。 本文件起草单位： 浙江 省农业科学院 、 浙江省动物疫病预防控制中心、 浙江国正检测技术有限公司。 本文件主要起草人：唐标、杨华、陈洁、代兵、吴静、马 剑钢、周炜、汪行舟、王小骊、吉小凤、 肖英平、汪雯、肖兴宁。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 080—2021 2 畜禽源和养殖 环境中沙门氏菌的分离及药敏试 验方法 1 范围 本文件规定了 畜禽源和养殖环境 中沙门氏菌 分离及药敏试验的术语和定义 、设备和材料、 试剂、培 养基和质控菌株、试验程序、样品处理、沙门氏菌分离 及确证、微量肉汤稀释法药敏试验 和生物安全 的 要求。 本文件适用于畜禽源和养殖环境中沙门氏菌的分离及药敏试验。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 4789.1 食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则 GB 4789.4 食品安全国 家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验 GB 4789.9 食品安全国家标准 食品微生物学检验 空肠弯曲菌检验 GB 4789.28 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 28642 饲料中沙门氏菌的快速检测方法聚合酶链式反应（ PCR）法 WS/T 639 抗菌药物敏感性试验的技术要 求 T/ZNZ 044 畜禽养殖过程中细菌耐药性监测方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 畜禽源 livestock and poultry source 源于猪、牛、羊、家禽等食品动物相关的组织、内容物、排泄物、分泌物等。 3.2 药敏试验 antimicrobial susceptibility testing 检测微生物（本文件特指细菌） 对抗微生物药物（本文件特指抗菌药物）的体外敏感性，以指导临 床合理选用药物的微生物学试验 。 3.3 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 080—2021 3 最低抑菌浓度 minimal inhibitory concentration ，MIC 在琼脂或肉汤稀释法药物敏感性检测 试验中能抑制肉眼可见的微生物 生长的最低抗菌药物浓度。 3.4 折点 breakpoint 能预测临床治疗效果， 用以判断测试菌株敏感（ Susceptible ，S） 、中介（ Intermediate ，I）和耐药 （Resistant，R）的最低抑菌浓度 （MIC）或抑菌圈直径（ mm）的数值 。 4 设备和材料 4.1 设备 开展细菌 分离的微生物实验室应符合 GB 19489 生物安全二级实验室（ BSL-2）要求，灭菌、培养 和鉴定设备按 GB 4789.1 和GB 4789.9 执行，其他设备如下： ——微量移液器：0.1 μL～2.5 μL、1 μL～10 μL、10 μL～100 μL、100 μL～1 000 μL； ——电子天平：感量 0.001 g； ——自动加样仪或多通道微量加样器： 1 μL～100 μL； ——核酸电泳仪 ； ——凝胶成像系统 ； ——聚合酶链式反应（ Polymerase Chain Reaction ，PCR）扩增仪； ——恒温培养箱： 36℃±1℃； ——冰箱： 2℃～8℃、-20℃、-80℃； ——麦氏比浊管和浊度仪：可测量范围 0.01麦氏单位～4.00麦氏单位； ——质谱鉴定仪： 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪 ，含常见病原菌数据库。 4.2 材料 需要用到 的相关实验材料 如下： ——无菌培养皿：直径 60 mm、90 mm； —— 96孔透明无菌微孔板： 每孔体积超过 100 μL； —— 1 μL一次性无菌接种环、 10 μL一次性无菌接种环； ——一次性无菌采样拭子； ——无菌水样采集袋、无菌棉棒、 标准比浊管 、冰袋； ——商品化药敏试验板。 5 试剂、培养基和质控菌株 5.1 实验用水 培养基配制用水应符合 GB 4789.28的规定，试剂配制用水应符合 GB/T 6682 的规定。 5.2 无菌生理盐水 无菌生理盐水 的制备按GB 4789.1 执行。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 080—2021 4 5.3 培养基 5.3.1 运送培养基：按GB 4789.28 执行。 5.3.2 缓冲蛋白胨水 （BPW）增菌液：按GB 4789. 4执行。 5.3.3 亚硒酸盐 胱氨酸（SC）增菌液 ：按GB 4789.4执行。 5.3.4 LB琼脂培养基：按T/ZNZ 044 执行。 5.3.5 XLT4培养基：按附录 A中表 A.1执行。 5.3.6 MH肉汤（ Mueller -Hinton broth ）：按WS/T 639 执行。 5.4 试剂 5.4.1 沙门氏菌诊断血清 试剂盒。 5.4.2 沙门氏菌显色培养基。 5.4.3 细菌 DNA提取试剂盒。 5.4.4 沙门氏菌特异性 PCR扩增引物。 5.4.5 PCR扩增试剂盒。 5.5 质控菌株 沙门氏菌标准 菌株 ATCC 14 028（Salmonell a typhimurium ，ATCC 1402 8），保存、传代等要求应按 照GB 4 789.28的要求执行。 6 试验程序 沙门氏菌 分离及药敏试验程序如图1所示。 图1 沙门氏菌 分离及药敏试验程序 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 080—2021 5 7 样品处理 7.1 样品采集 7.1.1 直肠/泄殖腔拭子采集 用无菌生理盐水浸润 一次性无菌采样拭子 ， 伸入家畜直肠或家禽泄殖腔 1.5 cm～2.0 cm，旋转 2圈～ 3圈，立即将 采样拭子置于 10 mL 运送培养基中 冷藏。 7.1.2 新鲜粪便采集 用一次性采样拭子 蘸取新鲜粪便，不应沾有泥土或其他污染物 ，立即将采样拭子及样 品置于 10 mL 运送培养基 中冷藏。 7.1.3 盲肠内容物采集 用一次性采样拭子蘸取盲肠内容物， 立即置于 10 mL运送培养基中 冷藏。 7.1.4 环境水样采集 用无菌水样采集袋封口处 直接接取 200 mL左右环境水样，包括畜禽舍冲洗用水、降温用水以及养 殖场生活污水等，避免 带入外源污染物， 密封后冷藏。 7.1.5 环境样本采集 用无菌棉棒擦拭各个养殖环境中物体表面，收集环境表面微生物，迅速置于无菌的含有 BPW增菌 液的密封袋中冷藏。 7.2 样品保存 样品采集后应密封保存 ，并加注样品标识，采 样记录和样品编码应详尽。 样品的保存应按照 GB 4789.1的要求执行 。 7.3 样品运输 采集的样品按 GB 4789. 1要求运达检验单 位，运输时间 不超过 24 h，运输工具应保持 清洁，运输和 装卸过程中应防 止包装破损和样品渗漏 。 7.4 样品接收 样品运至实验室时，应确认样品完好情况，应立即对样品进行增菌。 8 沙门氏菌分离及确证 8.1 增菌 8.1.1 BPW增菌 8.1.1.1 采样拭子预增菌 在无菌环境下，将采样拭子从运送培养基中取出，置于 5 mL BPW增菌液中搅动数次， 36℃ ± 1℃ ， 180 rpm 培养 4 h～6 h。应将运送培养基中的蘸有样本的琼脂尽可能全部转移至增 菌液中。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 080—2021 6 8.1.1.2 水样预增菌 50 mL水样在 4℃、4 000 rpm离心5 min，将 0.5 mL样品沉淀物加入 5 mL BPW增菌液中， 36℃ ± 1℃，180 rpm 培养 8 h～12 h。 8.1.1.3 环境样本预增菌 已置于 BPW中的环境样本，置于 36℃ ± 1℃ ，180 rpm培养 8 h～12 h。 8.1.2 SC增菌 取8.1.1中BPW增菌液