SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1315—2010 代替SN/T1315—2003 牛地方流行性白血病检疫技术规范 Protocol of quarantine for enzootic bovine leukosis 行业标准信息服务平台 2010-01-10发布 2010-07-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1315—2010 前 言 SN/T1315一2003相比，主要变化如下： 一标准名称改为《牛地方流行性白血病检疫技术规范》； -增加了临床诊断部分； 实验室诊断增加了病原分离鉴定、间接酶联免疫吸附试验、阻断酶联免疫吸附试验和核酸检测 方法： 对已有的琼脂凝胶免疫扩散试验的操作方法和结果判定进行了修订完善。 本标准的附录A、附录B、附录C均为规范性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：乔彩霞、张鹤晓、赖平安、高志强、吴丹、蒲静。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： SN/T1315—2003。 行业标准信息服务平台 1 SN/T 1315—2010 牛地方流行性白血病检疫技术规范 1范围 本标准规定了牛地方流行性白血病临床诊断和实验室诊断的操作内容。 本标准适用于牛地方流行性白血病的检疫。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 SN/T1917牛地方流行性白血病聚合酶链反应操作规程 3缩略语 下列缩略语适用于本标准。 3. 1 EBL 牛地方流行性白血病。 3.2 BLV 牛白血病病毒。 3.3 FBL 胎牛肺。 行业标准信息服务平台 3. 4 RIA 放射性免疫试验 3.5 PCR 聚合酶链反应。 3.6 AGID 琼脂凝胶免疫扩散。 3.7 ELISA 酶联免疫吸附试验。 4临床诊断 4.1流行病学 牛感染BLV后将终生带毒，成为传染源，其传播方式有垂直传播和水平传播两种。该疫病自 1878年发现于德国以来，目前在德国、波兰、罗马尼亚和前苏联等多数国家均有发生，而与我国近邻的 SN/T 1315—2010 日本也因输人性传播导致该病在全国蔓延。 4.2临床症状 牛白血病的潜伏期较长，可达4年～5年，多数感染牛不呈现临床症状，以在血液中存在白血病抗 体并出现持续的淋巴细胞增多症和异常淋巴细胞为特征。疫病发展形成肿瘤后则出现淋巴结肿大和一 些组织脏器的生理机能障碍，并表现体重减轻、贫血和泌乳减少等症状。 4.3病理变化 感染BLV后，病牛会出现淋巴结肿大，遍及全身各个脏器，形成大小不等的结节性或弥漫性肉芽肿 病灶。特别是真胃、心脏和子宫等为最常发的器官。 根据流行病学、临床症状和病理变化可作出牛地方流行性白血病的初步诊断，进一步的确诊有赖于 实验室诊断。 5实验室诊断 5.1病原分离及鉴定 5.1.1原理 BLV是一种外源反转录病毒，其主要靶细胞是B淋巴细胞。BLV不仅以前病毒的形式存在于感 染牛的血液淋巴细胞和肿瘤细胞中，而且存在于动物体的各种体液（鼻腔、支气管渗出液，睡液和牛奶 等）中，利用外周血液血淋巴细胞可对其进行培养分离，然后用电镜或BLV抗原测定法鉴定。也可直接 用PCR检查外周血和肿瘤中存在的BLV前病毒DNA。 5.1.2材料准备 5.1.2.1器材和设备：无菌注射器，倒置光学显微镜，二氧化碳培养箱，冰箱（一20℃保存血清， 一70℃保存种毒），无菌96孔细胞培养板，微量可调移液器（50μL、100μL），微量滴头，吸管（5mL、 10 mL)。 5.1.2.2试剂：淋巴细胞分离液、20%胎牛血清的MEM培养液和细胞分散液配制见附录A。 5.1.2.3胎牛肺细胞：无菌采取出生特牛肺，磨碎或剪碎，再用胰蛋白酶消化制备细胞，置37℃二氧化 碳培养箱，长成良好单层备用。 5.1.3样品制备 5.1.3.1样品采集 用无菌注射器或采血专用真空管针无菌从牛静脉采血并加入抗凝剂，采集样品立即放入4℃冰箱 保存，在24h内送到实验室。 5.1.3.2样品处理 取1.5mL抗凝血，轻轻加入等量的淋巴细胞分离液，注意不要摇动打乱液层，2000r/min离心 20min，离心后分成多层，最上层是血浆层，中间层是分离液，最下层是红细胞，在血浆层与分离液之间 是一层较致密的白色层，为淋巴细胞层，用毛细吸管插入并吸取该层放入另一离心管中，以PBS洗涤后 备用。 5.1.4病毒分离 取5.1.3.2得到的淋巴细胞与2×10°FBL细胞在40mL含20%胎牛血清的MEM中共同培养，置 于37℃5%二氧化碳培养箱，逐日观察细胞变化，并在3d～4d后收获培养物上清，保存于一70℃待 鉴定。 5.1.5病毒鉴定 病毒致细胞变化特点是细胞产生合胞体。取上述细胞培养物，经冻融、裂解两次后，以 原，并通过电子显微镜观察上清中包含的病毒粒子，或者用PCR方法检测上清中的BLV前病毒核酸 （方法见SN/T1917），从而确诊样品中是否包含有BLV。