SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1172—2014 代替SN/T1172—2003 鸡白血病检疫技术规范 Quarantine protocol for avain leukosis 行业标准信息服务平台 2014-11-19发布 2015-05-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1172—2014 前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准代替SN/T1172一2003《鸡白血病检测方法琼脂免疫扩散试验》。 本标准与SN/T1172一2003相比，主要技术变化如下： 增加了鸡白血病病毒分离与鉴定； 一增加了聚合酶链式反应； 一增加了荧光定量聚合酶链式反应； 一增加了酶联免疫吸附试验。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院， 本标准主要起草人：叶奕优、杨俊兴、曹琛福、胡运发、陈兵、孙洁、陶虹、唐金明、刘建利、谢晓露、 吕建强、卢体康、花群义、 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： -SN/T1172—2003。 行业标准信息服务平台 1 SN/T1172—2014 鸡白血病检疫技术规范 1范围 本标准规定了鸡白血病的病毒分离与鉴定、聚合酶链式反应、荧光定量聚合酶链式反应、酶联免疫 吸附试验、琼脂扩散试验的检测技术 本标准适用于鸡白血病的检疫。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T2123出人境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ALV:鸡白血病病毒 ALV-J:J亚群鸡白血病病毒 AGID:琼脂扩散试验 BSA：牛血清白蛋白 CEF：鸡胚成纤维细胞 ELISA：酶联免疫吸附试验 PBS:磷酸缓冲液 PCR：聚合酶链式反应 TMB:3,3',5,5°-四甲基联苯胺 标准信息 4 病毒分离与鉴定 4.1 试剂和材料 4.1.1主要试剂：DMEM细胞培养液、0.25%胰酶、青霉素（100000IU/mL）、链霉素（100000IU/mL）、 胎牛血清、细胞裂解液。 4.2 样品的采集、保存和运输 主要采集鸡全血、组织样品（脾脏、肝脏和肾脏）或喉拭子、泄殖腔拭子。样品的保存和运送按 SN/T2123进行操作。 4.3样品的处理 4.3.1全血：采集全血样品，放人加有抗凝剂的试管中，轻轻混匀；将试管直立静置于室温或37℃温箱 1 SN/T 1172—2014 中30min～60min，待红细胞自然沉降后，用毛细管吸取位于红细胞层上面的白细胞层和血浆，移入另 一试管中。 4.3.2组织样品：按组织样品质量的5倍加人生理盐水（含终浓度为200IU/mL的青霉素和链霉素）， 研磨或破碎至匀浆状态，5000r/min离心10min，收集上清液。 4.3.3拭子：将采集的喉拭子或泄殖腔拭子，放人盛有1.5mL生理盐水（含终浓度为200IU/mL的青 霉素和链霉素）的离心管中，剧烈振荡，5000r/min离心10min，收集上清液。 4.3.4细胞培养上清：用PBS(pH7.2~7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到106个/mL，反复冻融3次， 5000r/min离心20min，收集上清。 4.4病毒的分离培养 4.4.1细胞接种：接4.3.1、4.3.2或4.3.3中样品处理液（上清）经0.22um滤膜过滤后，接种单层DF1 细胞，置37℃培养箱培养2h，弃去接种物，用基础细胞培养液洗一次，加人维持液，置于37℃培养箱培 养5d~7d。 4.4.2细胞传代：将4.4.1中细胞培养物继续接种DF1单层细胞，置于37℃培养箱培养5d7d，盲传 2 代~3 代。 4.5病毒鉴定 5聚合酶链式反应(PCR) 5.1试剂和材料 5.1.1主要试剂 十二烷基硫酸钠（SDS）、蛋白酶K、苯酚、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、PCR反应缓冲液、TaqDNA 聚合酶、dNTP、琼脂糖、DNAmarker。 5.1.2主要仪器设备和器材 PCR仪、离心机、电流仪、电泳槽、凝胶成像系统、一20℃冰箱。 5.1.3对照样品 意服务平台 灭活ALV作为阳性对照，由指定单位提供。CEF或DF1细胞培养物可作为阴性对照。 5.1.4引物和序列 5.1.4.1检测ALVpol基因特异性引物： P1:5'-CTAACGAGGCGAGGGAATG-3' P2:5′-TTGGTGGGTTGGGTGGAGA-3' 扩增目的片段为214bp。 5.1.4.2检测ALV-Jenv基因特异性引物： P3:5'-GGATGAGGTGACTAAGAAAG-3 P4:5'-CGAACCAAAGGTAACACACG-3" 扩增目的片段为545bp。 2