ICS 13.060 CCS C 51 WS 中华人民共和国 卫生行业标准 WS/T 799—2022 污水中新型冠状病毒富集浓缩和核酸检测 方法标准 Method for enrichment and nucleic acid detection of SARS -CoV-2 in sewage 2022 - 03 - 24发布 2022 - 03 - 24实施 中华人民共和国国家卫生健康委员会 发布 WS/T 799 —2022 I 前言 本标准由国家卫生健康委环境 健康标准专业委员会负责技术审查和技术咨询，由中国 疾病预防控 制中心卫生标准处 负责协调性和格式审查，由国家卫生健康委员会疾控局负责业务管理、法规司负责统 筹管理。 本标准起草单位： 中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所 、清华大学、中国科学院生态 环境研究中心、中国疾 病预防控制中心病毒病预防控制所。 本标准主要起草人：张岚、唐宋、黄霞、杨敏、张晓、张良、王园媛、刘艳臣、田哲、段招军。 WS/T 799 —2022 1 污水中新型冠状病毒富集浓缩 和核酸检测方法标准 1 范围 本标准规定了污水中新型冠状病毒 富集浓缩和核酸 检测方法。 本标准适用于生活污水、医疗机构污水中新型冠状病毒 富集浓缩和核酸 检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本标准必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 标准。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 WS/T 697 新冠肺炎疫情期间特定人群个人防护指南 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 新型冠状病毒 severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2 属于 β属冠状病毒，基因组为线 性单股正链的 RNA病毒，全长约 30 kb，有包膜，呈圆形或椭圆形颗 粒状，直径为 60 nm～140 nm。 Ct值 cycle threshold 在实时荧光定量 PCR中，每个反应体系中的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 实时荧光反转录聚合酶链式反应 real-time fluorescent reverse transcription polymerase chain reaction 在反转录 DNA聚合酶链式反应的扩增反应中加入荧光化学物质，通过对扩增反应中每一个循环产 物荧光信号的实时检测实现对起始模板定量及定性的分析方法。 4 检出限 富集浓缩采用 聚乙二醇沉淀法 或铝盐混凝沉淀法时，方法 检出限为 10 copies/mL ；富集浓缩采用 离 心超滤法 时，方法 检出限为 100 copies/mL 。 5 水样的采集、运输及保存 根据采样场所排水系统分布情况，重点选取污水排水口、内部管网汇集处等关键位置对未经消杀处 理的污水进行采样。用无菌聚乙烯瓶采集污水样本，采样体积为 300 mL。可根据现场条件和检测需求 确 定水样采集方式，如瞬时水样（采样点位某一时间随机采集的样本）或混合水样（同一采样点位不同时 间所采集的瞬时水样混合后的样本）。样本采集后应在现场使用 75 %酒精对采样瓶外表面进行消毒，然 后将采样瓶装入密封采样袋中，对密封采样袋外表面再次进行消毒，并尽快将样本送至实验室，运输过 程中确保 0 ℃～4 ℃条件下冷藏运输。到达实验室后样本同样应保存于 0 ℃～4 ℃环境中，实验室应在 接到样本后 24 h内进行富集浓缩处理，并在富集浓缩后 24 h内完成核酸提取及实时荧光反转录聚合酶链 式反应（实时荧光 RT-PCR）检测。 6 病毒灭活 WS/T 799 —2022 2 将样本充分混匀后置于 60 ℃水浴30 min。 注：水浴锅水位应高于样本液面，确保容器内样本达到目标温度。 7 病毒富集浓缩 注： 本部分中三种新型冠状病毒富集浓缩方法适用条件相同，使用过程中 可根据实验条件进行选择。 聚乙二醇沉淀法 7.1.1 原理 向污水中加入聚乙二醇，聚乙二醇在一定盐浓度条件下可使病毒颗粒形成多聚体，在一定离心力下 将水溶液与病毒颗粒多聚体分开，收集病毒颗粒多聚体形成的沉淀，用于后续核酸提取和实时荧光 RT-PCR检测。 7.1.2 试剂和材料 7.1.2.1 试剂 7.1.2.1.1 聚乙二醇：分子生物学级，平均分子量 8 000。 7.1.2.1.2 氯化钠：分子生物学级。 7.1.2.1.3 无核酸酶水：分子生物学级。 7.1.2.2 材料 7.1.2.2.1 无菌带盖 离心管：1.5 mL，无核酸酶； 50 mL或250 mL，可承受离心力 ≥12 000 g。 7.1.2.2.2 无菌移液器吸头： 1 mL，带滤芯，无核酸酶。 7.1.2.2.3 无菌移液管： 50 mL。 7.1.3 仪器设备 7.1.3.1 高速冷冻离 心机：4 ℃，50 mL或250 mL转子，可承受离心力≥12 000 g。 7.1.3.2 电子天平：分辨力不低于 0.001 g。 7.1.3.3 生物安全柜： II级或II级以上。 7.1.3.4 高压灭菌器。 7.1.3.5 移液器： 1 mL。 7.1.3.6 大容量电动移液器。 7.1.4 富集浓缩步骤 7.1.4.1 预离心 用大容量电动移液器分别移取 3份35 mL污水样本置于 3个50 mL离心管中，在 4 ℃、2 500 g条件下离 心30 min，将上清液分别转移到另外 3个50 mL离心管中备用。剩余污水样本作为备份。 注1：当污水样本悬浮物含量过高， 可能影响病毒核酸提取和实时荧光 RT-PCR检测时，应采用预离心弃除悬浮物后再 进行后续操作。 注2：若选用250 mL离心管，可直接取 105 mL污水样本于 250 mL离心管中，在上述条件下离心后将上清液转移到另外 1个250 mL离心管中备用。 7.1.4.2 第二次离心 在3个装有35 mL污水样本或预离心后上清液的 50 mL离心管中分别加入 3.5 g±0.1 g聚乙二醇和 0.79 g±0.01 g氯化钠，充分混合，直至试剂完全溶解，该溶解过程约需 15 min。然后在 4 ℃、12 000 g 条件下离心 120 min，离心机降速时不应使用制动力。离心机停止后倾倒并弃除离心管中的上清液，至 无上清液流出。 注：若选用250 mL离心管，在装有 105 mL污水样本或预离心后上清液的 250 mL离心管中操作时，聚乙二醇和氯化钠 用量应等比例增加，其他操作相同。 7.1.4.3 富集浓缩 7.1.4.3.1 在4 ℃、12 000 g条件下将第二次离心后剩余的样本再次离心 5 min，离心机降速时 不应使WS/T 799 —2022 3 用制动力。离心机停止后用移液器从离心管中吸出并弃除剩余的上清液。 7.1.4.3.2 吸取0.4 mL无核酸酶水加入到其中的一个离心管中，反复吹吸沉淀，瞬时离心，使所有液 体聚集在管底，将混悬液吸出并加入到第二个离心管中。 7.1.4.3.3 重复吹吸沉淀和瞬时离心的操作后，再次将混悬液吸出并加入到第三个离心管中。 7.1.4.3.4 继续重复吹吸沉淀和瞬时离心的操作，最终形成的混悬液即为该水样的浓缩液，体积约为 0.6 mL。将浓缩液转移至 1.5 mL离心管中，于 0 ℃～4 ℃条件下保存，并于 24 h内完成核酸提取和 实 时荧光RT-PCR检测。 注：若选用250 mL离心管， 按照 7.1.4.3.1 条件再次离心并弃除剩余的上清液后， 在离心管中加入 0.4 mL无核酸酶水， 反复吹吸沉淀，并瞬时离心后即得到浓缩液。 铝盐混凝沉淀法 7.2.1 原理 向污水中加入铝盐混凝剂，铝盐水解产生的氢氧化铝胶体可吸附和包裹病毒颗粒，通过离心作用收 集含病毒的胶体， 然后通过化学溶解释放出包裹的病毒颗粒， 用于后续核酸提取和实时荧光 RT-PCR检测。 7.2.2 试剂和材料 7.2.2.1 试剂 7.2.2.1.1 实验用水： GB/T 6682 规定的一级水。 7.2.2.1.2 氯化铝溶液 [c（AlCl 3）=0.3 mol/L]：称取4 g无水氯化铝（纯度 ≥99 %），置于烧杯中， 加入100 mL水，搅拌溶解后转移至试剂瓶中。 7.2.2.1.3 氢氧化钠溶液 [c（NaOH）=1 mol/L]：称取4 g氢氧化钠（ 纯度≥96 %），置于烧杯中，加入 100 mL水，搅拌溶解后转移至试剂瓶中。 7.2.2.1.4 盐酸溶液 [c（HCl）=1 mol/L]：移取43 mL盐酸（分析纯， ρ20=1.19 g/mL）于烧杯中，加入 适量水，用玻璃棒搅拌混匀后转移至 500 mL容量瓶中，并定容至刻度。 7.2.2.1.5 乙二胺四乙酸二钠二水合物（ C10H14N2O8Na2·2H 2O）：纯度≥98 %。 7.2.2.2 材料 7.2.2.2.1 无菌螺口锥形瓶： 100 mL。 7.2.2.2.2 无菌带盖离心管： 10 mL、50