ICS11.020 CCSC50 WS 中华人民共和国卫生行业标准 WS/T478—2024 代替WS/T478—2015 血清25-羟基维生素D2和D3的检测 同位素稀释液相色谱串联质谱法 Measurementofserum25-hydroxyvitaminD2andD3——Isotopedilution liquidchromatographytandemmassspectrometry 2024-05-09发布 2024-11-01实施 中华人民共和国国家卫生健康委员会  发布WS/T478—2024 I前言 本标准为推荐性标准。 本标准代替WS/T478—2015《血清25-羟基维生素D3检测操作指南同位素稀释液相色谱串联质谱法》， 与WS/T478—2015相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下： ——更改了“范围”（见第1章，2015年版的第1章）； ——更改了“术语和定义”（见第3章，2015年版的第3章）； ——更改了“符号与缩略语”（见第4章，2015年版的第4章）； ——更改了“检测原理和方法”（见第5章，2015年版的第5章）； ——更改了“试剂和配制”（见第6章，2015年版的第6章）； ——更改了“仪器”（见第7章，2015年版的第7章）； ——更改了“样品”（见第8章，2015年版的第8章）； ——更改了“检测系统和分析部分的准备”（见第第9章，2015年版的第9章）； ——更改了“方法的评价”（见第10章，2015年版的第10章）。 本标准由国家卫生健康标准委员会临床检验标准专业委员会负责技术审查和技术咨询,由国家卫生 健康委医疗管理服务指导中心负责协调性和格式审查,由国家卫生健康委员会医政司负责业务管理、法 规司负责统筹管理。 本标准起草单位：首都医科大学附属北京世纪坛医院、中国医学科学院北京协和医院、上海市徐汇 区中心医院、北京医院/国家卫生健康委临床检验中心、中南大学湘雅医院、北京大学人民医院、天津 医科大学总医院、郑州大学第三附属医院。 本标准主要起草人：张曼、刘娜、邱玲、李水军、张江涛、易斌、岳志红、门剑龙、袁恩武、周慧。 本标准于2015年首次发布，本次为第一次修订。WS/T478—2024 1血清25-羟基维生素D2和D3的检测 同位素稀释液相色谱串联质谱法 1范围 本标准规定了血清25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3检测的常规方法-同位素稀释液相色谱串 联质谱法的技术要求，包括试剂配制、样品制备、仪器检测、数据分析等内容。 本标准适用于医疗机构临床实验室利用同位素稀释液相色谱串联质谱法检测血清25-羟基维生素D2 和25-羟基维生素D3。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本标准必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 内标internalstandard 在定量分析时，加入到样品中作为参比物的已知量的化合物纯品。 3.2 检出限limitofdetection 检测方法在规定的实验条件下所能检出分析物的最低浓度。 3.3 定量检测下限lowerlimitofmeasuringinterval 在满足实验室对准确性和精密度要求的前提下，检测方法在规定的实验条件下所能准确定量检测分 析物的最低可测量浓度或量。 3.4 线性linearity 在给定的测量范围内，使测定结果与样品中分析物的量直接成比例的能力。此处的测定结果指 最终的分析结果，而非仪器输岀的原始信号。 [来源：WS/T408—2012,定义2.2] 3.5 线性范围linearrange 使实验系统的最终分析结果为可接受的线性的浓度范围，此时非线性误差应低于允许误差。WS/T478—2024 2[来源：WS/T408—2012,定义2.3] 3.6 基质效应matrixeffect 标本中除分析物之外的样品性质对分析物测定结果的影响。 4符号与缩略语 下列符号与缩略语适用于本标准。 25(OH)VD2：25-羟基维生素D2(25-HydroxyvitaminD2) 25(OH)VD3：25-羟基维生素D3(25-HydroxyvitaminD3) BSA：牛血清白蛋白(bovineserumalbumin) CV：变异系数(coefficientofvariation) LOD：检出限(limitofdetection) LLMI：定量检测下限(lowerlimitofmeasuringinterval) MRM：多反应监测(multiplereactionmonitor) S/N：信噪比(signaltonoiseratio) 5检测原理和方法 本标准建立的25(OH)VD2和25(OH)VD3检测方法以同位素稀释液相色谱串联质谱法为检测原理。方 法是以稳定同位素标记的25(OH)VD2和25(OH)VD3为内标添加至血清中，内标与血清均匀混合后，通过 加入碳酸盐缓冲溶液释放出与蛋白结合的25(OH)VD2和25(OH)VD3，加入正己烷-乙酸乙酯混合溶液将其 从血清当中萃取出来，将萃取液用氮气吹干，用流动相初始比例溶液进行复溶。利用液相色谱串联质谱 分离并检测血清25(OH)VD2、25(OH)VD3和内标特异的离子对。通过建立的标准品工作曲线以25(OH)VD2、 25(OH)VD3与各自内标峰面积比计算血清25(OH)VD2和25(OH)VD3浓度。 6试剂和配制 6.1试剂 可选用的试剂如下： a)水：除非有特别说明，应使用GB/T6682定义的一级水； b)甲醇：色谱纯； c)正己烷：色谱纯； d)甲酸：色谱纯； e)乙酸乙酯：色谱纯； f)磷酸氢二钠七水合物(Na2HPO4•7H2O)：分析纯，CAS号：7782-85-6； g)磷酸二氢钠一水合物(NaH2PO4•H2O)：分析纯，CAS号：10049-21-5； h)氯化钠：分析纯，CAS号：7647-14-5； i)碳酸钠：分析纯，CAS号：497-19-8； j)碳酸氢钠：分析纯，CAS号：144-55-8； k)牛血清白蛋白(BSA):纯度≥98％，Mr=66kDa，CAS号：9048-46-8； l)氢氧化钠：分析纯，CAS号：1310-73-2； m)25(OH)VD2标准品：纯度≥98％，CAS号：21343-40-8； n)25(OH)VD3标准品：纯度≥98％，CAS号：19356-17-3； o)25(OH)VD2-[2H3]：同位素标记纯度≥97％，CAS号：1217467-39-4 p)25(OH)VD3-[2H3]：同位素标记纯度≥97％，CAS号：140710-94-7WS/T478—2024 36.2配制溶液 6.2.1空白基质溶液 模拟人血清基质的条件，选择适当离子强度、适当pH及蛋白成分的物质进行配制，尽量模拟人血 清基质的环境。如获得人血清纯化后无25(OH)VD2和25(OH)VD3的空白基质为更佳。适用时，可釆用下 述方法进行： a)称量2.14gNa2HPO4•7H2O，0.268gNaH2PO4•H2O，0.9g氯化钠，5g牛血清白蛋白； b)溶解于约75mL水中； c)用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH到7.4； d)转移到100mL容量瓶中； e)加水定容至100mL。 该溶液2℃～8℃稳定期为1个月，长期保存应加入防腐剂。 6.2.2碳酸盐缓冲溶液配制 适用时，可采用下述方法进行配制： 分别配制浓度为0.1g/mL的NaHCO3溶液10mL，0.1g/mLNa2CO3溶液40mL，在不断搅拌的情况 下向NaHCO3溶液中逐滴加入Na2CO3溶液，同时测量混合溶液的pH值，直到混合溶液的pH值为10.0， 室温密封避光保存，稳定3个月。 6.2.3正己烷-乙酸乙酯混合溶液 适用时，可采用下述方法进行配制： 将200mL正己烷和200mL乙酸乙酯混合得到体积比为50:50的正己烷-乙酸乙酯混合溶液，室温 密封避光保存可稳定3个月。 6.2.4内标溶液及标准溶液的制备 可根据生产厂商说明进行符合要求的相应调整，适用时，可采用下述方法进行配制。 6.2.4.1内标工作液 配置方法如下： 分别取同位素标记的25(OH)VD2和25(OH)VD3，加入甲醇，配置浓度为50ng/mL内标工作液。 6.2.4.2标准品工作液 配制方法如下： 分别取25(OH)VD2和25(OH)VD3标准品，加入甲醇及空白基质溶液，配置浓度为5ng/mL,10ng/mL, 20ng/mL,50ng/mL,100ng/mL,200ng/mL的标准品工作液。 6.2.5流动相A 适用时，可釆用含0.1％甲酸的水溶液，配制方法为移取300mL水，加入0.3mL甲酸，混匀后超 声排除液体中气泡。流动相宜根据每日使用量新鲜配制。 6.2.6流动相B 适用时，可釆用含0.1％甲酸的甲醇溶液，配制方法为移取300mL甲醇，加入0.3mL甲酸，混匀 后超声排除液体中气泡。由于甲醇为易挥发溶剂，宜根据每日使用量进行配制。 6.2.7质控品 质控品与待测样品应具有相似或相同的基质，具有较好的均匀性和稳定性。 7仪器WS/T478—2024 47.1液相色谱串联质谱检测系统 液相色谱串联质谱检测系统（以三重四极杆质谱仪为例）应满足以下使用要求： a)高效液相色谱仪； b)三重四极杆串联质谱仪，装配稳定的离子源，如大气压化学电离源(APCI)、