ICS 11.020 CCS C 50 WS 中华人民共和国 卫生行业标准 WS/T 360—2024 代替 WS/T 360—2011 流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南 Guideline for enumeration of peripheral blood lymphocyte subsets by flow cytometry 2024 - 04 - 02发布 2024 - 09 - 01实施 中华人民共和国国家卫生健康委员会 发布 WS/T 360 —2024 I 前言 本标准为推荐性标准。 本标准代替 WS/T 360—2011《流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南》 ，与 WS/T 360—2011相比， 除结构调整和编辑性改动外，主要技术内容变化如下： ——增加了流式细胞仪性能 验证内容(见5.1)； ——完善了仪器质量控制和项目性能 验证内容(见5.2、7.2.2)； ——梳理和保留了检验前、检验中、检验后 过程的内容及要求 (见第6、7、8章)； ——删减了标本采集和处理及临床意义内容（见 2011年版的第4、10章）； ——增加了淋巴细胞亚群六色分析方案 (见4.1.3、附录C)。 本标准由国家卫生健康标准委员会临床检验标准专业委员会负责技术审查和技术咨询， 由国家卫生 健康委医疗管理服务指导中心负责协调性和格式审查，由国家卫生健康委员会医政司负责业务管理、 法 规司负责统筹管理。 本标准起草单位：中国医学科学院肿瘤医院、北京医院 /国家卫生健康委临床检验中心、北京大学 第一医院、中国医学科学院北京协和医院、上海市 交通大学医学院附属 第一人民医院、上海交通大学医 学院附属新华医院、上海长征医院、苏州大学附属第一医院 /江苏省血液研究所。 本标准主要起草人：崔巍、彭明婷、屈晨雪、黄春梅、李莉、沈立松、周琳、朱明清、崔婵娟、李 臣宾。 本标准于 2011年首次发布，本次为第一次修订。 WS/T 360 —2024 1 流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南 1 范围 本标准规定了流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群： T淋巴细胞（包括 CD4+T细胞和CD8+T细胞）、 B 淋巴细胞和 NK细胞的技术要求。 本标准适用于医疗机构临床实验室开展流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本标准必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用 于本标准。 WS/T 806 临床血液与体液检验基本技术标准。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 细胞分化抗原 cluster of differentiation ；CD 不同谱系细胞在分化、发育、活化过程中，出现或消失的细胞表面标志。 注1: 细胞表面标志通常采用对应的单克隆抗体来识别。 注2:已被命名的抗体有指定的 CD编号，被特定抗体识别的特定抗原通常具有相同的编号。例如，被“抗 CD1抗体” 识别的抗原称为“ CD1抗原”。 3.2 前向散射光 forward scatter ；FSC 光学检测器在入射光的正前方所收集的低角度散射光信号 。 注: FSC与细胞或颗粒的大小和折射指数有关。 3.3 侧向散射光 side scatter ；SSC 光学检测器在入射光的直角处所收集的细胞散射的光信号 。 注: SSC与细胞或颗粒的内部及表面结构复杂程度有关，如细胞质颗粒性、膜不规则性及核 型等。 3.4 设门 gating 在流式细胞图上基于一组参数来确定所要分析的目的细胞群，对 该限定区域内的目的细胞群通过其 他参数（如荧光参数）进一步分析其表达情况 的过程。 3.5 荧光强度 fluorescence intensity 结合到细胞或颗粒上的 单克隆抗体 荧光素多与少的量化指标。 注1:在恰当的条件下，荧光强度与一个细胞或颗粒和特定荧光素相结合的位点数相关。即细胞或颗粒结合的荧光素 越强意味着目标标记分子的数量越多，反之越少。荧光强度越强则荧光信号的通道 值也越大，反之越小。 WS/T 360 —2024 2 注2:荧光强度常通过相对荧光强度值的大小来表示，有算 术平均荧光强度（ mean fluorescence intensity ，MFI）、 几何平均 （Geometric Mean ）和中位荧光强度（ Median fluorescence intensity ，MdFI）3种计算方式。 3.6 染色指数 staining index ；SI 量化评估阳性与阴性细胞群的分离程度的指标。 注1: SI通过阳性细胞群平均荧光强度（ MFI）与阴性细胞群 MFI的差，除以阴性细胞群 荧光强度 的2倍标准差计算而 来[SI=（MFI阳性群-MFI阴性群）/2×rSD阴性细胞群]，用于比较不同荧光染料在流式细胞术应用中荧光强度的差异。 注2: SI越大，荧光强度越高。进行抗体滴度 测定时需根据 SI来确定最适合的抗体用量。 3.7 荧光补偿 fluorescence compensation 由于一种荧光素发射的荧光叠加到其他荧光素发射 荧光的波长范围内而造成荧光信号重叠，通过在 其他荧光信号中扣除已测定荧光信号的一部分从而纠正发射波长重叠造成的计数错误 的过程。 注: 扣除的荧光量是用同型抗体来确定的，被校正的信号反映了单荧光信号的发射情况。 3.8 荧光微球 fluorescent beads 一种表面结合特定荧光染料或内部包含一种或多种荧光染料用于流式细胞检测的人造微球颗粒。 注: 常用的荧光微球包括以下 3种：1）校准微球：与染色细胞大小和荧光强度相似的微球，用于检测每个荧光通道 的线性、灵敏度和检测水平，也可用来检测抗体结合量或抗原密度。 2）标准微球：大小一致、荧光强度与染 色细胞相似的微球，用于检测通道的电压设置和荧光补偿设置。 3）绝对计数微球：已知数量或浓度的荧光微 球，与待测单细胞悬液在同一管中进行检测，以准确获得 待测细胞的绝对计数。 3.9 相对细胞计数 relative cell counts 计算靶细胞群中目的细胞亚群数量的一种方法，计数结果以目的细胞亚群数量占靶细胞群细胞数量 的百分比来表示。 注: 相对细胞计数单位： ％ 3.10 绝对细胞计数 absolute cell counts 计算靶细胞群中目的细胞亚群数量的一种方法，计数结果以每微升样品中目的细胞亚群的实际个数 来表示。 注: 绝对细胞计数 单位：个/µL 3.11 单平台方法 single-platform method 用于流式细胞术测定细胞绝对数量的一种方法，结果由流式细胞仪直接测定完成，无须使用第二种 仪器测定。 注: 单平台方法可通过流式细胞仪结合绝对计数微球或精确进样体积等方法对目的细胞亚群进行绝对细胞计数。 3.12 双平台方法 dual-platform method 用于测定细胞绝对数量的一种方法。结果来源于流式细胞仪和另一种仪器的检测 。 注: 另一种仪器通常是血细胞分析仪。采用流式细胞仪获取靶细胞群中目的细胞亚群的比例（如淋巴细胞中 CD4+T 细胞的比例），靶细胞群通常是淋巴细胞群或白细胞群。采用血细胞分析仪测定同一样品中靶细胞群的绝对浓 度 （如淋巴细胞绝对值） 。这两个检测结果相乘所得即为目的细胞群的绝对数量 （如 CD4+T细胞绝对细胞计数） 。 4 试剂和检测系统的选择 WS/T 360 —2024 3 4.1 荧光素标记的单克隆抗体 宜选择荧光素直接标记的单克隆抗体，同时考虑所选抗体对细胞的反应性。单克隆抗体宜选择细胞 分化抗原 CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD16、CD56。淋巴细胞亚群临床检测试剂应符合国家医疗器械 注册要求。 4.1.1 单克隆抗体的细胞抗原识别 CD45为白细胞共同抗原，主要表达于白细胞； CD3为T淋巴细胞共同抗原，主要表达于成熟 T淋巴细 胞；CD4主要表达于辅助 /诱导T淋巴细胞（ CD4+T细胞），也少量表达于 单核/树突状细胞 等；CD8表达于 细胞毒T淋巴细胞（CD8+T细胞）和 少部分NK细胞等； CD19通常表达于 B淋巴细胞 和少量浆细胞；CD16表 达于NK细胞、粒细胞、 部分单核/树突状细胞等； CD56表达于NK细胞和细胞毒 T细胞等。 4.1.2 淋巴细胞亚群的鉴定抗体 宜至少使用联合 CD45的四色抗体组合方案。 CD4、CD8、CD16和CD56单克隆抗体均不能专一标记淋巴 细胞某一亚群，应采用联合 CD45、CD3和多种抗体组合共同标记来鉴定淋巴细胞亚群。采用 CD45作为设 门抗体，兼做质控试剂。 CD45联合SSC设门圈取淋巴细胞，尽可能排除其他细胞或颗粒干扰，门内淋巴 细胞的纯度应≥ 95％。如果样品中的淋巴细胞数量较少或者单核细胞对淋巴细胞分群有干扰，推荐同时 加入CD14作为设门抗体 ，圈取CD14-细胞群。 CD3+T细胞标记为 CD3+，CD4+T细胞标记为 CD3+CD4+CD8-，CD8+T 细胞标记为 CD3+CD4-CD8+，B细胞标记为 CD3