SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1145—2014 代替SN/T1145—2002 首宿黄萎病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Verticillium albo-atrum Reinke & Berthold 行业标准信息服务平台 2014-04-09发布 2014-11-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T1145—2014 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准代替SN/T1145—2002《植物检疫首猎黄萎病菌检疫鉴定方法》，与SN/T1145—2002相 比，除编辑性修改外主要技术变化如下： 增加了分子生物学及蛋白质谱检测内容； 增加了附录C、附录D、附录E、附录F。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 检疫科学研究院。 本标准起草人：章桂明、王颖、程颖慧、汪莹、王伍、吴品珊、杜洪忠。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： SN/T1145—2002。 行业标准信息服务平台 I SN/T1145—2014 首宿黄萎病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了首黄萎病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于首黄萎病菌的寄主携带首黄萎病菌的检疫鉴定。 2定义和术语 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 轮状分生孢子梗 verticillateconidiophore 轮枝菌的分生孢子梗类型，在直立的分生孢子梗每节基部膨大处轮生若干个小梗，可以有1轮 5轮。 2.2 厚垣孢子chlamydospore 由菌丝个别细胞膨大形成，具有厚壁和浓缩的原生质，可抵抗高温、低温、干旱、营养短缺等不良环 境条件的一种休眠孢子。 2.3 微菌核microsclerotium 暗褐色或黑色近球形坚硬的休眠体，由单一菌丝体不断芽殖聚集而来。 2.4 休眠菌丝体restingmycelium 3基本信息 中文名：首黄萎病菌 学名:Verticillium albo-atrum Reinke &.Berthold 分类地位：真菌界（Fungi），无性型真菌（Anamorphicfungi），丝孢纲（Hyphomycetes），丝孢目 （Hyphomycetales），丛梗孢科（Moniliaceae），轮枝孢属（Verticillium）。 传播途径：首猎黄萎病菌主要由种子传播，也可经土壤、病残体、风、灌溉水和昆虫传病。 近似种：大丽轮枝菌Verticilliumdahliae、变黑轮枝菌V.nigrescens、云状轮枝菌V.nubilum、三体 轮枝菌V.tricorpus。 4方法原理 该病菌的为害症状、形态学特征、分子生物学特征及蛋白质谱特征是鉴定该病菌的依据。 1 SN/T1145—2014 5仪器及用具 5.1仪器 冰机、纯水仪、涡旋振荡器、台式离心机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、真空抽干仪、冰箱、超净工作 荡仪。 5.2用具 培养血、载玻片、盖玻片、三角瓶、试管、烧杯、手术刀、手术剪、镊子、研钵、量筒、吸管、酒精灯、滤纸、 微量移液器（0.5μL，2μL10μL20μL，100μL，200μL，1000μL）PCR反应管（0.2mL，0.5mL）、Tip 头（0.1μ~10μ，5μ~200μL，100μL1000L）、质谱分析样品靶。 6试剂和培养基 6.1试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。 2%~3%次氯酸钠溶液、无水乙醇、75%乙醇、无菌去离子水、2，4-D钠盐、CTAB提取缓冲液、Tris 饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、RNaseA、液氮、PCR试剂（包括TaqDNA聚合酶、dNTPs、缓冲液、 MgClz）、DNAMarker、溴化乙锭、琼脂糖、TAE电泳缓冲液、TaqManMasterMix、特异性引物和探 针、乙腈、三氟乙酸（TFA）、甲醇、α-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA）、质谱校正标准液（肽标准品及蛋白标 准品）。 6.2培养基 雅信息服务 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、梅干煎汁酵母琼脂培养基（PLYA）、马铃薯葡萄糖液体培养基， 参见附录A。 7 抽样与现场检查 7.1首种子的抽样 按以下标准抽样：1.5kg~10kg取1份；11kg~100kg取2份；101kg～500kg取3份；501kg~ 1000kg取4份。每份样品为1.5kg。1.5kg以下全部取样。 7.2首种苗、植株的抽样 按以下标准抽样：50株以下取1份；51株～200株取2份；201株～1000株取3份；1001株~ 5000株取4份；5001株以上每增加5000株增取1份，不足5000株的按5000株计。每份样品5株。 7.3现场检查 首种子抽样时注意检查种子中有无可疑带病种子、首残体；植株抽样时注意检查有无可疑病 株。如有可疑病种、病株应将其挑出来，送实验室作进一步检验鉴定。 2