ICS 13.060.01 CCS Z17 团体 标准 T/PSC 1.4—2022 船舶压载水检测方法 第4部分：肠道球菌 Determination for ballast water of ships—— Part 4: Intestinal Enterococci 2022 - 01 - 01发布 2022 - 07 - 01实施 中国太平洋学会 发布 全国团体标准信息平台 T/PSC 1.4 —2022 I 目次 前 言 ................................ ................................ ........... II 1 范围 ................................ ................................ ................ 1 2 规范性引用文件 ................................ ................................ ...... 1 3 术语和定义 ................................ ................................ .......... 1 4 方法原理 ................................ ................................ ............ 1 5 试剂和材料 ................................ ................................ .......... 1 6 仪器与设备 ................................ ................................ .......... 1 7 样品采集 ................................ ................................ ............ 2 8 样品检测 ................................ ................................ ............ 2 9 结果计算与表示 ................................ ................................ ...... 3 10 质量保证和控制 ................................ ................................ ..... 3 11 废物处理 ................................ ................................ ........... 3 附录 A （资料性） 97孔定量盘结果检索表 ................................ ........... 4 附录 B （资料性） 检测结果记录表 ................................ .................. 8 参考文 献 ................................ ................................ ........ 9 全国团体标准信息平台 T/PSC 1.4 —2022 II 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件为 T/PSC 1—2021《船舶压载水检测 方法》的第4部分，T/PSC 1—2021已经发布了以下部分： ——船舶压载水检测方法 第1部分：大于等于 50 μm活体生物； ——船舶压载水检测方法 第2部分：大于等于 10 μm且小于50 μm活体生物； ——船舶压载水检测方法 第3部分：大肠埃希氏菌。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由中国太平洋学会东海环境分会提出。 本部分由中国太平洋学会归口。 本部分起草单位：上海海洋大学、国家海洋局东海环境监测中心、国家海洋局东海标准计量中心。 本标准主要起草人 :吴惠仙、王琼、薛俊增、张昊飞、袁林、陈琼、徐超群。 全国团体标准信息平台 T/PSC 1.4 —2022 1 船舶压载水检测方法 第4部分：肠道球菌 1 范围 本文件规定了酶底物法测定船舶压载水中肠道球菌的方法原理、试剂和材料、仪器与设备、样品采 集、样品检测、结果计算与表示、质量控制和保证 和废物处理。 本文件适用于酶底物法检测船舶压载水中的肠道球菌。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 17378.4 海洋监测规范 第4部分：海水分析 IMO MEPC.300(72) ：2018 压载水管理系统认可规则（ Code for approval of ballast water management systems (BWMS CODE) ） IMO BWM.2/Circ.42/ Rev.2：2020符合BWM公约和G2指南要求的压载水取样和分析试验指南 （Guidance on ballast water sampling and analysis for trial use in accordance with the BWM Convention an d Guidelines(G2) ） 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 方法原理 在特定温度下培养特定的时间，肠道球菌能产生β -D-葡萄苷酶，将选择性培养基中的底物 4-甲基 伞形酮β -D-葡萄苷 （4-MUG） 分解， 分解后的产物 4-甲基伞形酮在 366 nm紫外灯照射下产生特征性荧光。 统计出现荧光反应的孔格数量， 通过查 97孔定量盘结果检索表 (附录A)， 计算样品中肠道球菌的浓度值。 5 试剂和材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 水，GB/T 6682 ，二级，使用前经 121 ℃高压蒸汽灭菌 20min。 5.1 市售Enterolert 培养基或其他等效产品。 5.2 生理盐水： 0.85%氯化钠溶液，使用前经 121 ℃高压蒸汽灭菌 20min。 5.3 阳性对照标准菌株：肠球菌有证标准菌株。 5.4 阴性对照标准菌株：大肠埃希氏菌有证标准菌株。 5.5 6 仪器与设备 全国团体标准信息平台 T/PSC 1.4 —2022 2 显微镜，目镜放大倍数 10倍，物镜放大倍数 100倍。 6.1 恒温培养箱，能够恒温至 41 ℃，控温精度± 1 ℃。 6.2 高压蒸汽灭菌器，能够加热至 121 ℃。 6.3 紫外灯， 366 nm。 6.4 封口机。 6.5 无菌样品瓶， 100 mL。 6.6 三角瓶， 100 mL。 6.7 定量盘， 97孔。 6.8 血球计数器。 6.9 试验中使用的玻璃器皿和采样器具应按无菌操作要求包扎， 于 121 ℃高压蒸汽灭菌 20min， 烘干， 6.10 备用。灭菌后的采样瓶，两周内未使用，应重新灭菌。 7 样品采集 据IMO MEPC.300(72) ：2018及IMO BWM.2/Circ.42 ：2020的要求采集水样， 4 ℃冷藏保存，于 7.1 24 h内完成检测。 采样时现场同时测定水样盐度并记录。盐度的测定按 GB/T 17378.4 中要求执行。 7.2 8 样品检测 样品稀释 8.1 8.1.1 盐度小于 1的水样无需稀释，直接接种。 8.1.2 盐度大于等于 1的水样，取 10 mL待测水样加入到装有 90 mL生理盐水 （5.3）的三角瓶（ 6.7） 中混匀稀释后待接种。 接种 8.2 8.2.1 盐度小于 1的水样， 量取 100 mL置于无菌样品瓶 （ 6.6） 中， 加入 1支Enterolert 培养基 （5.2）， 振摇至完全溶解后，倒入定量盘（ 6.8），抚平背面去除孔内气泡，用封口机封口待培养。 8.2.2 盐度大于等于 1的水样，量取 100 mL按8.1.2稀释的水样置于无菌样品瓶（ 6.6）中，加入 1 支Enterolert 培养基（ 5.2），振摇至完全溶解后，倒入定量盘（ 6.8），抚平背面去除孔内气泡，用 封口机封口待培养。 培养 8.3 将经8.2处理的定量盘置于恒温培养箱（ 6.2）中在41 ℃±1 ℃下培养 24 h。 结果判读与计数 8.4 8.4.1 对完成培养的定量盘进行结果判读。在 366 nm紫外灯照射下有蓝色荧光，则判断为肠道球菌阳 性孔，分别记录定量盘中大阳性孔和小阳性孔数量 ，