2 0 2 3 0 2 1 7 发 布 － － 2 0 2 3 0 6 0 1 － － 实 施 水 产 养 殖 环 境 （ 水 体 、 底 泥 ） 中 孔 雀 石 绿 、 结 晶 紫 及 其 代 谢 物 残 留 量 的 测 定 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 法 5 0 中 华 人 民 共 和 国 水 产 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 5 0 C C S B 9 4 4 1 — 2 0 2 3 D e t e r m i n a t i o n o f m a l a c h i t e g r e e n , c r y s t a l v i o l e t a n d t h e i r m e t a b o l i t e s r e s i d u e s i n w a t e r a n d s e d i m e n t f r o m a q u a c u l t u r e e n v i r o n m e n t s b y L C - M S / M S m e t h o d S C ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布SC/T９４４１—２０２３ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部渔业渔政管理局提出. 本文件由全国水产标准化技术委员会渔业资源分技术委员会(SAC/TC１５６/SC１０)归口. 本文件起草单位:中国水产科学研究院、浙江省海洋水产研究所、中粮营养健康研究院、北京科德诺思 技术有限公司. 本文件主要起草人:李晋成、梅光明、杨悠悠、李芹、房金岑、刘欢、韩刚、孙慧武、张小军、何雅静、谢云 峰、刘琪、孙涛、闻瑞琪. ⅠSC/T９４４１—２０２３ 水产养殖环境(水体、底泥)中孔雀石绿、结晶紫及其 代谢物残留量的测定　液相色谱Ｇ串联质谱法 １　范围 本文件描述了液相色谱Ｇ串联质谱法测定水产养殖环境中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物隐色孔雀石 绿、隐色结晶紫残留量方法的原理、试剂和材料、仪器和设备、样品的采集与保存、样品处理、测定、结果计 算和检测方法灵敏度、准确度、精密度. 本文件适用于水产养殖环境水体、底泥中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物隐色孔雀石绿、隐色结晶紫残 留量的测定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅 该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB１７３７８􀆰５　海洋监测规范　第５部分:沉积物分析 SC/T９１０２􀆰１　渔业生态环境监测规范　第１部分:总则 SC/T９１０２􀆰２　渔业生态环境监测规范　第２部分:海洋 SC/T９１０２􀆰３　渔业生态环境监测规范　第３部分:淡水 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　原理 水样采用二氯甲烷提取;底泥试样经冷冻干燥后研磨均匀,用乙腈/二氯甲烷混合溶液提取,推杆式滤 过型中性氧化铝净化柱净化.待检测液供液相色谱Ｇ串联质谱测定孔雀石绿、结晶紫及其代谢物残留量, 内标法定量. ５　试剂和材料 所有试剂,除另外有说明外,均为分析纯试剂;所有试剂经液相色谱Ｇ串联质谱仪测定不得检出孔雀石 绿、结晶紫及其代谢物.实验用水应符合GB/T６６８２中规定的一级水. ５􀆰１　试剂 ５􀆰１􀆰１　二氯甲烷(CH２Cl２):色谱纯. ５􀆰１􀆰２　乙腈(CH３CN):色谱纯. ５􀆰１􀆰３　甲酸(HCOOH):色谱纯. ５􀆰１􀆰４　乙酸铵(NH４CH２COOH):分析纯. ５􀆰２　溶液配制 ５􀆰２􀆰１　乙腈/二氯甲烷混合液:取９０mL乙腈(５􀆰１􀆰２)和１０mL二氯甲烷(５􀆰１􀆰１),混合均匀,现用现配. ５􀆰２􀆰２　乙酸铵溶液(５mmoL/L,含０􀆰１％甲酸):称取０􀆰３８５g乙酸铵溶解于水中,加入１mL甲酸 (５􀆰１􀆰３),用水定容至１０００mL,过０􀆰２２μm微孔滤膜(水相). ５􀆰２􀆰３　乙腈(含０􀆰１％甲酸)溶液:精确量取１mL甲酸(５􀆰１􀆰３),用乙腈(５􀆰１􀆰２)定容至１０００mL. ５􀆰２􀆰４　初始流动相:５０mL流动相A(５􀆰２􀆰１)和５０mL流动相B(５􀆰２􀆰２)混合均匀,现用现配. １SC/T９４４１—２０２３ ５􀆰３　标准品 ５􀆰３􀆰１　孔雀石绿(MG)、隐色孔雀石绿(LMG)、结晶紫(CV)及隐色结晶紫(LCV)标准品:含量≥９７􀆰０％, 标准物质详细信息见附录A. ５􀆰３􀆰２　氘代孔雀石绿(MGＧD５)、氘代隐色孔雀石绿(LMGＧD６)、氘代结晶紫(CVＧD６)和氘代隐色结晶紫 (LCVＧD６)标准品:含量≥９７􀆰０％,标准物质详细信息见附录A. ５􀆰４　标准溶液配制 ５􀆰４􀆰１　标准储备液(１００􀆰０μg/mL):准确称取适量的孔雀石绿(MG)、隐色孔雀石绿(LMG)、结晶紫 (CV)及隐色结晶紫(LCV)标准品,分别用乙腈(５􀆰１􀆰２)溶解并定容,配制成浓度为１００􀆰０μg/mL的标准 储备液,于－１８℃避光保存,有效期６个月. ５􀆰４􀆰２　内标标准储备液(１００􀆰０μg/mL):准确称取适量的氘代孔雀石绿(MGＧD５)、氘代隐色孔雀石绿 (LMGＧD６)、氘代结晶紫(CVＧD６)和氘代隐色结晶紫(LCVＧD６)标准品,分别用乙腈(５􀆰１􀆰２)溶解并定容, 配制成浓度为１００􀆰０μg/mL的内标储备液,于－１８℃避光保存,有效期６个月. ５􀆰４􀆰３　混合标准中间液(１􀆰０μg/mL):分别准确吸取１􀆰０mL孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结 晶紫的标准储备液(５􀆰４􀆰１)于１００mL容量瓶中,用乙腈(５􀆰１􀆰２)稀释定容,配制成浓度为１􀆰０μg/mL的混 合标准中间液,于－１８℃避光保存,有效期２个月. ５􀆰４􀆰４　混合内标标准中间液(１􀆰０μg/mL):分别准确吸取１􀆰０mL氘代孔雀石绿、氘代隐色孔雀石绿、氘 代结晶紫和氘代隐色结晶紫内标储备液(５􀆰４􀆰２)于１００mL容量瓶中,用乙腈(５􀆰１􀆰２)稀释定容,配制成浓 度为１􀆰０μg/mL的混合内标标准中间液,于－１８℃避光保存,有效期２个月. ５􀆰４􀆰５　混合标准使用液(０􀆰１０μg/mL):准确吸取１􀆰０mL混合标准中间液(５􀆰４􀆰３)于１０mL容量瓶中, 用乙腈(５􀆰１􀆰２)稀释定容,配制成浓度为０􀆰１０μg/mL的混合标准使用液,于－１８℃避光保存,有效期１ 个月. ５􀆰４􀆰６　混合内标标准使用液(０􀆰１０μg/mL):准确吸取１􀆰０mL混合内标标准中间液(５􀆰４􀆰４)于１０mL容 量瓶中,用乙腈(５􀆰１􀆰２)稀释定容,配制成浓度为０􀆰１０μg/mL的混合内标标准使用液,于－１８℃避光保 存,有效期１个月. ５􀆰５　标准溶液配制 ５􀆰５􀆰１　微孔滤膜(水相):０􀆰４５μm、０􀆰２２μm. ５􀆰５􀆰２　微孔滤膜(有机相):０􀆰２２μm. ５􀆰５􀆰３　推杆式滤过型中性氧化铝净化柱:中性氧化铝,５０mg/３mL. ６　仪器和设备 ６􀆰１　高效液相色谱Ｇ串联质谱仪:配电喷雾离子源(ESI). ６􀆰２　天平:感量０􀆰０１g. ６􀆰３　分析天平:感量０􀆰０００１g. ６􀆰４　高速离心机:转速≥８０００r/min. ６􀆰５　冷冻干燥机. ６􀆰６　氮吹仪. ６􀆰７　旋转蒸发仪. ６􀆰８　抽滤装置. ６􀆰９　涡旋混合器. ６􀆰１０　网筛:１００目. ７　样品的采集与保存 ７􀆰１　按照SC/T９１０２􀆰１、SC/T９１０２􀆰２和SC/T９１０２􀆰３规定的方法采集样品. ２SC/T９４４１—２０２３ ７􀆰２　水样通过抽滤装置过０􀆰４５μm水相滤膜去除大颗粒杂质,置于玻璃瓶中,待检测. ７􀆰３　底泥先于－２０℃预冷冻２４h,经冷冻干燥机(－５０℃,真空度＜２０Pa,冷冻干燥１０h)冷冻干燥后, 剔除石块和植物体,用研钵研磨后过１００目网筛,置于广口玻璃瓶瓶中,待检测. ８　样品处理 ８􀆰１　水体 准确量取７􀆰２过膜后水样１００mL(精确至０􀆰１mL),置于２５０mL分液漏斗中,加入２０μL混合内标 标准使用液(５􀆰４􀆰６),再加入５０mL的二氯甲烷(５􀆰１􀆰１),振摇５min,静置３０min,取下层二氯甲烷于 ２５０mL鸡心瓶中,再往２５０mL分液漏斗中加入５０mL二氯甲烷(５􀆰１􀆰１)重复提取１次,若分层不明显, 取其下层液于５０mL离心管中,冷冻离心机６０００r/min离心３min,再取下层液于２５０mL鸡心瓶中,合 并二氯甲烷提取液,４５℃旋转蒸发浓缩至近干,残留物加入２􀆰０mL初始流动相(５􀆰２􀆰４)复溶,过０􀆰２２μm 微孔滤膜(有机相)后,上机测定. ８􀆰２　底泥 ８􀆰２􀆰１　准确称取７􀆰３过筛后粉末状底泥样品２􀆰００g(精确至０􀆰０１g)于５０mL聚乙烯离心管中,加入 ２０μL混合内标标准使用液(５􀆰４􀆰６),加入２mL水,涡旋３０s,浸润处理１０min,然后加入３０mL乙腈/二 氯甲烷混合液(５􀆰２􀆰１),涡旋２min,振荡提取６０min,以８０００r/min离心５min,移取上层清液转移于 １００mL鸡心瓶中.４５℃旋转蒸发至近干,使用１mL乙腈(５􀆰１􀆰２)复溶,待净化. ８􀆰２􀆰２　拉动推杆式滤过型中性氧化铝净化柱活塞抽取复溶液,推动活塞并接收流出液,加入５mmoL/L 乙酸铵溶液(５􀆰２􀆰２)并定容至２