ICS 07.100.99 CCS B41 T/ZNZ 浙 江 省 农 产 品 质 量 安 全 学 会 团 体 标 准 T /ZNZ 088—2021 水禽鸭疫里默氏杆菌的分离及药敏 试验方 法 Isolation and antimicrobial susceptibility testing of Riemerella anatipestifer from waterfowl 2021 - 10 - 28发布 2021 - 11 - 28实施 浙江省农产品质量安全学会 发布 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 088—2021 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》 的规定起 草。 本文件的某些内容可能涉及专利。本文件发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由浙江省农产品质量安全学会 提出并归口。 本文件起草单位：浙江省农业科学院农产品质量安全与营养研究所、浙江省农业科学院畜牧兽医研 究所、浙江国伟科技有限公司、金华金婺农业发展有限公司、 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 。 本文件主要起草人：唐标、杨华、朱寅初、 陈斌丹、马剑钢、 吴静、冯伟峰、刘玉庆、张存、王小 骊、卢立志、汪 建妹、肖英平、汪雯 、黄学涛、肖兴宁、 曾涛、黄雨婷。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 088—2021 1 水禽鸭疫里默氏杆菌的分离及药 敏试验方法 1 范围 本文件规定了水禽鸭疫里默氏杆菌（ Riemerella anatipestifer ）的分离及药敏试验方法中的设备和材 料、培养基、试剂和参考菌株 、试验程序、分离 纯化、确证、微量肉汤稀释法药敏试验 及生物安全的要 求。 本文件适用于水禽鸭疫里默氏杆菌的分离及药敏 实验。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 4 789.1 食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则 GB 4789.9 食品安全国家标准 食品微生物学检验 空肠弯曲菌检验 GB 4789.11 食品安全国家标准 食品微生物学检验 β型溶血性链球菌检验 GB 4789.28 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 WS/T 639 抗菌药物敏感性试验的技术要求 DB37/T 3880 鸭疫里默氏杆菌病诊断技术规程 T/ZNZ 044 畜禽养殖环节细菌耐药性监测方法 CLSI M100 ED30 美国临床实验室标准化委员会抗微生物药敏试验标准 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 鸭疫里默 氏杆菌 Riemerella anatipestifer 黄杆菌科，里氏杆菌属 ；革兰氏染色阴性，瑞氏染色可见两极着色 ；菌体呈杆状或椭圆形，多为单 个散在， 部分成双或短链状排列 ，可形成荚膜，无芽孢，无鞭毛 ；该菌血清型众多，临床主要感染包括 鸭、鹅等水禽， 致病致死能力强 。 3.2 药敏试验 antimicrobial susceptibili ty testing 检测微生物（本文件特指细菌） 对抗微生物药物（本文件特指抗菌药物）的体外敏感性，以指导临 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 088—2021 2 床合理选用药物的微生物学试验 。 3.3 最低抑菌 浓度 Minimal inhibitory concentration ，MIC 在琼脂或肉汤稀释法药物敏感性检测试验中能抑制肉眼可见的微生物生长的 最低抗菌药物浓度。 4 设备和材料 4.1 设备 开展细菌耐药性监测微生物实验室应符合 GB 19489 生物安全二级实验室（ BSL-2）要求，灭菌、 培养和鉴定设备按 GB 4789.1 和GB 4789.9 执行，其他设备如下： ——微量移液器 ：0.1 μL～2.5 μL、1 μL～10 μL、10 μL～100 μL；100 μL～1 000 μL； ——电子天平：感量 0.001 g； ——自动加样仪或多通道微量加样器： 10 μL～100 μL； ——二氧化碳培养箱：提供 5%～10% 二氧化碳条件、 36 ℃ ± 1 ℃； ——冰箱： 2 ℃～8 ℃、－20 ℃、－80 ℃； ——麦氏比浊管和浊度仪：可测量范围 ：0.01 麦氏单位～4.00 麦氏单位； ——核酸电泳仪； ——凝胶成像系统； ——聚合酶链式反应（ PCR）扩增仪； ——微生物生化鉴定系统 ：含生化鉴定卡 ； ——质谱鉴定仪：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪，含常见病原菌数据库。 4.2 材料 需要用到的相关实验材料如下： ——无菌培养皿：直径 60 mm、90 mm； —— 96孔透明无菌微孔板：每孔体积超过 100 μL； —— 1 μL一次性无菌接种环、 10 μL一次性无菌接种环； ——无菌采集袋、无菌棉棒、标准比浊管、冰袋； ——生化鉴定试剂盒； ——商品化药敏试验板。 5 培养基、试剂和参考菌株 5.1 实验用水 培养基制备用水 应符合 GB 4789.28，试剂配制用水应符合 GB/T 6682 的规定。 5.2 培养基 5.2.1 胰蛋白胨大豆肉汤（ Tryptone soybean broth, TSB ）培养基 ：按GB 4789.11 执行。 5.2.2 5% 绵羊血 TSB琼脂平板 及其制备按附录 A中表 A.1执行。 5.3 试剂 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 088—2021 3 5.3.1 细菌基因组提取试剂盒。 5.3.2 鸭疫里默氏杆菌 特异性 PCR扩增引物按照 DB37/T 3880 执行。 5.3.3 PCR扩增试剂盒。 5.3.4 瑞氏染色液的制备按附录 A中表 A.2执行。 5.3.5 3% 过氧化氢（ H2O2）溶液的制备按 GB 4789.11 执行。 5.3.6 磷酸盐缓冲液（ PBS）制备按 GB 4789.28 执行。 5.3.7 革兰氏染色液的制备按 GB 4789.11 执行。 5.4 参考菌株 5.4.1 药敏试验质控菌株 药敏试验板 质控菌株使用 大肠埃希菌 ATCC 25922 。 5.4.2 阳性对照菌株 阳性对照菌株 使用鸭疫里默氏杆菌 ATCC 11845 。 6 试验程序 水禽鸭疫里默氏杆菌 分离及药敏试验程序如图1所示。 图1 鸭疫里默氏杆菌 分离及药敏试验程序 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 088—2021 4 7 分离纯化 7.1 样品 7.1.1 采集 采集具典型临床症状（纤维素性渗出、心包炎、肝周炎等）的 发病或死亡水禽的 血液、心包积液、 肝、脾、脑等组织 。 7.1.2 保存 样品采集后应密封保存，并加注样品标识，采样记录和样 品编码应详尽。 样品的保存应按照 GB 4789.1的要求执行 。 7.1.3 运输 采集的样品按 GB 4789.1 要求运达检验单位，运输时间不超过 24 h，运输工具应保持清洁，运输和 装卸过程中应防止包装破损，样品渗漏 。 7.1.4 接收 样品运至实验室时，应确认样品完好情况。 7.2 分离 采用平板划线法。用无菌接种环深入组织内部或接触血液、组织（液） ，于 5% 绵羊血 TSB琼脂 平板上分区划线，置 36 ℃± 1 ℃、含 5%～10% CO 2 的二氧化碳培养箱中培养 24 h～48 h。 7.3 纯化 鸭疫里默氏杆菌在 5% 绵羊血 TSB琼脂平板上可形成约 1 mm～2 mm的灰白色圆形隆起菌落， 表 面光滑，边缘整齐，大多不溶血。根据观察菌落形态，挑取可疑单菌落应用革兰氏染色和瑞氏染色染色 后镜检结果应符合鸭疫里默氏杆菌病原学的基本特征。 取染色观察后疑似单菌落进行平板划线，平置 36 ℃±1 ℃、含 5%～10% CO 2 的二氧化碳培养箱 中培养 24 h～48 h，从平板上挑取单菌落 3个～5个，分别转移至 2 mL～3 mL含5%马血清的 TSB增 菌液， 36 ℃ ±1 ℃条件下， 使用 200 rpm转速振荡培养 24 h～48 h，TSB培养物呈现上下均一浑浊。 使用无菌接种环蘸取培养物划线接种 5% 绵羊血 TSB血平板，于 36 ℃±1 ℃、含 5%～10% CO 2 的 二氧化碳培养箱中培养 24 h～48 h，备用。 8 确证 8.1 PCR法 8.1.1 DNA提取 将7.3中纯化后保存备用的鸭疫里默氏杆菌可疑菌落在 5% 绵羊血 TSB琼脂平板上活化， 参照 DB37/T 3880 ，挑取单菌落用采用煮沸法 提取 DNA，或使用细菌基因组提取试剂盒 提取 DNA。 8.1.2 扩增 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 088—2021 5