ICS65.020.30 B43 团体标准 T/SDAA0046－2021 2021－11－30发布 2021－12－31实施 山东省畜牧协会发布动物粪便中产气荚膜梭菌的检测 DetectionofClostridiumperfringensinanimalfeces 全国团体标准信息平台 T/SDAA0046－2021 全国团体标准信息平台 T/SDAA0046－2021 前言 本文件按照GB/T1.1—2020的规定起草。 本文件由山东省畜牧协会提出并归口。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件起草单位：青岛农业大学、南京农业大学、青岛农业大学海都学院、山东省农业科学院家禽 研究所。 本文件主要起草人：陈甫，邱慧玲，费荣梅，韩先杰，李福伟，朱连勤，高善颂，孙京新，于忠娜。 全国团体标准信息平台 T/SDAA0046－2021 全国团体标准信息平台 T/SDAA0046－2021 动物粪便中产气荚膜梭菌的检测 1范围 本文件规定了动物产气荚膜梭菌（Clostridiumperfringens）的检测方法。 本方法适用于畜禽粪便和胃肠内容物中产气荚膜梭菌的分离鉴定。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日 期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包 括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3原理 根据产气荚膜梭菌能分泌α毒素和θ毒素使血琼脂培养基产生溶血现象，初步筛选可疑 菌；根据产气荚膜梭菌为革兰氏阳性杆菌、α毒素能分解卵黄中的卵磷脂在卵黄琼脂培养基 上产生卵磷脂酶乳白色浑浊圈和最为突出的生化特性：发酵牛乳中的乳糖使牛乳酸凝并产生 大量气体使凝块破裂成多孔海绵状“暴裂发酵”现象，初步鉴定产气荚膜梭菌；根据本菌 16srDNA基因序列设计一对特异性引物，以DNA核酸为模板扩增一段特异的目的基因片 段，经琼脂糖凝胶电泳确定PCR产物大小为220bp，确定产气荚膜梭菌。 4试剂或材料 除非另有规定，所用试剂均为分析纯。 4.1水：GB/T6682一级。 4.2哥伦比亚血琼脂培养基。 4.3甘露醇卵黄琼脂培养基。 4.4含铁牛乳培养基。 4.5革兰氏染色液。 4.630%甘油磷酸盐缓冲液。 4.7PCRMIX（Taq、dNTP、MgCl2、10×PCRbuffer）。 4.8DNAMarkerDL5000。 4.9琼脂糖。 4.10电泳缓冲液。 全国团体标准信息平台 T/SDAA0046－2021 4.111.0%琼脂糖凝胶。 5仪器设备 5.1冰箱：-20℃～10℃。 5.2天平：感量0.01g。 5.3显微镜：10×～100×。 5.4无菌试管：18mm×180mm。 5.5无菌培养皿：直径90mm。 5.6一次性塑料注射器：10mL。 5.7恒温培养箱：37℃±1℃。 5.8厌氧培养装置。 5.9旋涡混合器。 5.10超声波清洗器。 5.11气浴摇床。 5.12PCR仪。 5.13电泳仪。 5.14凝胶成像系统。 5.15高速台式离心机，转速不低于13000rmp/min。 5.16电热恒温鼓风干燥箱。 5.17压蒸汽灭菌器。 6样品 样品采集按照NY/T541规定执行，4℃下保存和运输，24h内送检。粪便样品应选新 鲜粪便至少10.0g，使用带螺帽容器或灭菌塑料袋运送。肛拭子样品应取无菌棉拭子插入肛 门或泄殖腔中，旋转2~3圈，刮取直肠黏液或粪便，放入装有30%甘油磷酸盐缓冲液中送 检。肠道内容物样品应在烧烙肠壁表面，用移液器或一次性注射器扎穿肠壁，从肠腔内吸取 内容物放入装有30%甘油磷酸盐缓冲液中送检，或将带有粪便的肠管两端结扎，从两端剪 短送检。 全国团体标准信息平台 T/SDAA0046－2021 7试验步骤 7.1取样 棉拭子样品旋涡混匀30s，静置1min。粪便或肠道内容物样品经无菌操作称取5.0 g±0.02g试样于含20mL生理盐水灭菌50mL离心管中，旋涡混匀30s，静置1min。 7.2分离培养 吸取上层稀释液0.05mL，加入哥伦比亚血琼脂培养基平皿内均匀涂布。置于厌氧培养 装置内，37℃±1℃培养20h～24h。典型的产气荚膜梭菌为带有溶血环的灰色磨面粗糙菌落， 菌落形态图参见附录图A.1。 7.3初步鉴定 将可疑菌落进行卵磷脂酶试验、牛乳发酵试验和革兰氏染色鉴定，表现有卵磷脂酶乳光 浑浊圈、“暴烈发酵”现象和革兰氏阳性的菌落，可初步确定为产气荚膜梭菌。 7.3.1卵磷脂酶试验 挑取单个菌落接种至甘露醇卵黄琼脂培养基中，37℃±1℃培养12h～24h，典型菌落在 卵黄琼脂培养基中呈现表面粗糙、边缘不整、圆形不透明的菌落，周围出现卵磷脂酶乳光浑 浊圈，菌落呈现明显的外周低中部高内部低的“火山口”样外观，乳光浑浊带图参见附录图 A.2。 7.3.2牛乳发酵试验 挑取单个菌落接种至含铁牛乳培养基中，37℃±1℃培养12h～24h，出现“暴烈发酵”现 象，牛乳凝固，产生大量气体使凝固的牛乳呈蜂窝状，并置于培养基上层，“暴烈发酵”现 象图参见附录图A.3。 7.3.3革兰氏染色镜检 挑取单个菌落涂片，革兰氏染色镜检。产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗大的短杆菌，两端 钝圆，呈短链状，无鞭毛，有芽孢，革兰氏染色图参见附录图A.4。 全国团体标准信息平台 T/SDAA0046－2021 7.4PCR鉴定 7.4.1DNA模板的制备 将样品取至1.5mL塑料离心管中，12000rpm/min离心去上清液，加入100µL灭菌水 混匀，反复冻融3次，12000rpm/min离心10min，取上清液作为DNA模板。 7.4.2引物设计 根据产气荚膜梭菌16srDNA基因序列（AB045285.1）设计2条引物，L： 5'-AGGTGGCGAGCGTTATCC-3'，R：5'-ATAACCCAACATCTCACGACAC-3'。 7.4.3目的基因的扩增 以7.4.1中DNA模板进行PCR扩增。反应采用25μL反应体系，扩增条件为94℃预变 性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共35个循环；最后72℃延伸10min， 16℃保持。PCR反应体系如表1。 表1PCR反应体系 组分 体积/管 上游引物 1µL 下游引物 1µL PCRMIX 12.5µL DNA模版 2µL ddH2O 8.5µL 合计 25μL 7.4.4PCR产物鉴定 用1×TAE缓冲液配制1%琼脂糖凝胶，在微波炉中融化，加入GoldView（100mL琼脂 糖凝胶溶液加入5μLGoldView），摇匀，待琼脂糖凝胶完全凝固后进行电泳。电泳时，取5 µLPCR产物与1μL电泳上样缓冲液混合均匀，小心加到凝胶孔中，先用100V电压进行电 泳，待样品完全进入凝胶后，用80V电压进行电泳。当片段到达理想位置后停止电泳，取 凝胶在凝胶成像分析系统中观察结果并摄影。产物大小为220bp的条带，凝胶电泳图参见 附录图A.5。 全国团体标准信息平台 T/SDAA0046－2021 8结果判定 全部符合以下特性者应判为产气荚膜梭菌，不符合者为其他菌。 8.1在血琼脂平板上形成圆形、表面粗糙、边缘不整的菌落，菌落周围有溶血环； 8.2在甘露醇卵黄琼脂培养基中菌落周围出现卵磷脂酶乳光浑浊圈。 8.3在含铁牛乳培养基中呈现“暴烈发酵”现象，产生大量气体使凝固的牛乳呈蜂窝状。 8.4革兰氏阳性粗大的短杆菌，两端钝圆，呈短链状，无鞭毛，有芽孢。 8.5PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，参照DNAMarker中DNA条带，大小约为220bp。 9废弃物处理和防止污染的措施 检测过程中的废弃物，收集后高压灭菌处理。 附录A （资料性） A.1产气荚膜梭菌在血琼脂平板上形成的溶血现象见图A.1 图A.1产气荚膜梭菌在血琼脂平板上形成的溶血环图 全国团体标准信息平台 T/SDAA0046－2021 A.2产气荚膜梭菌在甘露醇卵黄琼脂培养基上形成的卵磷脂酶乳光浑浊带见图A.2 图A.2产气荚膜梭菌在甘露醇卵黄琼脂培养基上形成的卵磷脂酶乳光浑浊带图 A.3产气荚膜梭菌在含铁牛乳培养基中出现“暴烈发酵”现象见图A.3 图A.3产气荚膜梭菌在含铁牛乳培养基中出现“暴烈发酵”现象图 全国团体标准信息平台