! 7 ,     江苏省市场监督管理局 发　布 中 国 标 准 出 版 社 出　版传染病突发公共卫生事件应急处置 技术规范　第 11部分 ：细菌类应急 检测技术 Technical specification for emergency response of public health 　 emergent event caused by infections disease —Part 11：Emergency detection methods of pathogenic bacterium 2024 -12-27发布 2025 -01-27实施CCS C 50 DB32/T 4972.11—2024ICS 13.100 DB32/T 4972.11—2024 前言…………………………………………………………………………………………………………… Ⅲ 引言…………………………………………………………………………………………………………… Ⅳ 1 范围………………………………………………………………………………………………………… 1 2 规范性引用文件 …………………………………………………………………………………………… 1 3 术语和定义 ………………………………………………………………………………………………… 1 4 实验室生物安全要求 ……………………………………………………………………………………… 1 5 准备工作和质量控制 ……………………………………………………………………………………… 2 6 常用显微镜检查技术 ……………………………………………………………………………………… 2 7 分离培养 …………………………………………………………………………………………………… 2 8 分子生物学应急检测技术 ………………………………………………………………………………… 3 9 免疫学应急检测技术 ……………………………………………………………………………………… 5 参考文献 ………………………………………………………………………………………………………… 6目　　次 ⅠDB32/T 4972.11—2024 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第 1部分：标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 本文件是 DB32/T 4972《传染病突发公共卫生事件应急处置技术规范 》的第 11部分。DB32/T 4972 已经发布了以下部分 ： ——第1部分：监测预警 ； ——第2部分：事件报告和管理 ； ——第3部分：风险评估 ； ——第4部分：现场流行病学调查 ； ——第5部分：恢复评估 ； ——第6部分：应急消毒处置及应急人员个人防护 ； ——第7部分：媒介生物应急监测 、评估与控制 ； ——第8部分：标本的采集 、保存和运输 ； ——第9部分：应急检测流程 ； ——第10部分：病毒类应急检测技术 ； ——第11部分：细菌类应急检测技术 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由江苏省卫生健康委员会提出并组织实施 。 本文件由江苏省卫生健康标准化技术委员会归口 。 本文件起草单位 ：江苏省疾病预防控制中心 、南京鼓楼医院 、江苏省人民医院 、南京农业大学 、中国疾 病预防控制中心传染病预防控制所 、无锡市疾病预防控制中心 。 本文件主要起草人 ：谈忠鸣、王慎骄、周璐、崔仑标、周万青、刘根焰、张炜、王鑫、管红霞、胡建利、钱慧敏、 董晨、洪捷、彭杰夫。 ⅢDB32/T 4972.11—2024 引 言 传染病突发公共卫生事件是江苏省公共卫生安全的主要威胁 ，对社会、经济和人群健康存在巨大影 响。本文件为贯彻落实 《中华人民共和国传染病防治法 》 《中华人民共和国突发事件应对法 》 《突发公共卫 生事件应急条例 》等法律法规对传染病突发公共卫生事件的应急处置要求 ，提升江苏省传染病突发公共 卫生事件的应急处置能力 ，保障人民群众的生命安全和社会稳定的目标而制定 。 DB32/T 4972《传染病突发公共卫生事件应急处置技术规范 》由以下 11个部分构成 ： ——第1部分：监测预警 ； ——第2部分：事件报告和管理 ； ——第3部分：风险评估 ； ——第4部分：现场流行病学调查 ； ——第5部分：恢复评估 ； ——第6部分：应急消毒处置及应急人员个人防护 ； ——第7部分：媒介生物应急监测 、评估与控制 ； ——第8部分：标本的采集 、保存和运输 ； ——第9部分：应急检测流程 ； ——第10部分：病毒类传染病突发公共卫生事件应急检测技术 ； ——第11部分：细菌类传染病突发公共卫生事件应急检测技术 。 DB32/T 4972的制定是对传染病突发公共卫生事件处置工作相关国家标准 、行业标准的有力补充 ， 为开展传染病突发公共卫生事件的监测预警 、报告和管理 、风险评估 、现场流行病学调查 、恢复评估 、应急 消毒处置和个人防护 、媒介生物的应急监测评估与控制 、标本的采集和检测等应急处置工作提供有力的 科学依据和技术支撑 ，对保障公众健康和公共卫生安全具有重要意义 。 ⅣDB32/T 4972.11—2024 传染病突发公共卫生事件应急处置 技术规范　第 11部分：细菌类应急 检测技术 1 范围 本文件规定了细菌类应急检测的实验室生物安全要求 、准备工作和质量控制 、常用显微镜检查技术 、 分离培养 、分子生物学应急检测技术和免疫学应急检测技术等 。 本文件适用于传染病突发公共卫生事件应急处置中细菌类传染病病原体的应急检测 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件 ；不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本 文件。 GB 19489　实验室生物安全通用要求 WS 233　病原微生物实验室生物安全通用准则 WS 288　肺结核诊断 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 3.1 致病菌 pathogenic bacterium 能引起人类疾病的细菌 ，统称为致病菌或病原菌 。 3.2 高通量测序 high⁃throughput sequencing 可在较短时间内确定目标区域中核苷酸的顺序 ，用于细菌全基组或病原宏基因测的大规模并行测序 技术。 注： 又称“下一代”测序技术 （"Next⁃generation" s equencing technology ）。 4 实验室生物安全要求 4.1 实验人员应根据 GB 19489和风险评估的要求 ，配备不同类型传染病感染的个人防护装备 ，包括但 不限于防护服 、手套、外科口罩或医用防护口罩 、防护面屏 、防护帽。防护服宜每隔 4 h更换一次 。在发 生意外暴露时 ，根据应急处置预案采取必要措施 。 4.2 实验人员 、实验场所 、感染性标本处置及消毒灭菌等应符合 WS 233中的实验室生物安全管理 要求。 4.3 医疗废物处置应按照 《医疗废物管理条例 》规定执行 。 1DB32/T 4972.11—2024 5 准备工作 和质量控制 5.1 准备工作 根据实验需要 ，选择相应的生物安全柜 、移液器、漩涡震荡仪 、离心机等仪器和检测试剂耗材 。 5.2 质量控制 每一批次反应过程中应至少设置一个阴性和阳性对照 ，必要时增加空白对照 。 6 常用显微镜检查技术 6.1 生理盐水湿片镜下检测 在玻片上滴加适量生理盐水 ，将适量样本与生理盐水混合并涂抹均匀后 ，观察中性粒细胞 、红细胞及 其数量；观察标本中细菌动力特征 （用暗视野显微镜观察 ）等。 6.2 革兰氏染色显微镜检查 6.2.1 直接在玻片上涂抹标本 ，涂片应薄且均匀 。自然干燥或恒温干燥器上干燥后 ，经甲醇固定或火焰 快速固定 3次，革兰染色 ，晾干后读片 。 6.2.2 革兰染色脱色时间因选用不同的脱色剂而异 。使用革兰氏染色仪染色 ，应按照厂家操作说明书 进行。 6.3 抗酸染色显微镜检查 抗酸染色镜检操作流程应按照 WS 288执行。 6.4 荧光染色显微镜检查 荧光染色显微镜检查 步骤如下 ： a）染色：涂片经火焰固定后 ，滴加金胺 “O”染色剂盖满玻片 ，染色 30 min，流水自玻片一端轻缓冲 洗，洗去染色液 ，沥去玻片上剩余的水 ； b）脱色：涂膜上端外缘滴加脱色剂 ，盖满玻片 ，脱色 3 min 或至无色 ，流水自玻片一端轻洗 ，洗去脱 色剂； c）复染：加复染剂复染 1 min，沥去复染液 ，流水自玻片一端轻洗 ，自然干燥后镜检 ； d）镜检：玻片涂膜面向上置于荧光或 LED显微镜载物台 ，并以卡尺固定后 ，以低倍镜搜索发现疑 为致病菌的荧光物质 ，使用 40×物镜确认 。在暗背景下 ，目标菌发出荧光 ，呈特征形态 。 6.5 其他特殊染色显微镜检查 细菌特殊结构如芽孢 、鞭毛、荚膜或其他细菌结构如细胞壁 、核质、胞质颗粒等 ，采用相应的特殊染色 法进行显微镜检查 。包括且不限于细胞壁染色 、鞭毛染色 、荚膜染色 、芽孢染色 、异染颗粒染色 。 7 分离培养 7.1 无菌部位标本 一般应在患者使用抗生素之前采集无菌部位标本如血液标本直接接种血培养瓶中培养 ，阳性血培养 2DB32/T 4972.11—2024 物进行固体培养基分离纯化 ，并进行后续进一步鉴定 ，对血培养阴性的标本盲传一代 。 7.2 非无菌部位标本 非无菌部位标本 ，通过直接培养或选择性增菌培养的方式 ，针对不同