! 7 ,     江苏省市场监督管理局 　　发　布 中 国 标 准 出 版 社 　　出　版粳稻品种真实性和纯度 SSR分子 标记检测法 Variety genuineness and purity testing of japonica rice with SSR markers 2024 -12-27发布 2025 -01-27实施CCS B 21 DB32/T 4964—2024ICS 65.020.20DB32/T 4964—2024 目 次 前言…………………………………………………………………………………………………………… Ⅲ 1 范围………………………………………………………………………………………………………… 1 2 规范性引用文件 …………………………………………………………………………………………… 1 3 术语和定义 ………………………………………………………………………………………………… 1 4 总则………………………………………………………………………………………………………… 1 5 检测方法 …………………………………………………………………………………………………… 2 5.1 基本要求 ……………………………………………………………………………………………… 2 5.2 真实性检测 …………………………………………………………………………………………… 2 5.3 纯度检测 ……………………………………………………………………………………………… 2 5.4 引物合成 ……………………………………………………………………………………………… 2 6 结果报告 …………………………………………………………………………………………………… 5 附录 A （资料性） 等位基因扩增片段信息 ………………………………………………………………… 6 ⅠDB32/T 4964—2024 前 言 本文件按 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第 1部分：标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件江苏省农作物标准化技术委员会提出 、归口并组织实施 。 本文件起草单位 ：扬州大学 、江苏省种子管理站 。 本文件主要起草人 ：冯志明、左示敏、陈宗祥、宋锦花、杨华、方明奎、沈雨晴、吕甜、高鹏、纪萌萌、 杜海波。 ⅢDB32/T 4964—2024 粳稻品种真实性和纯度 SSR分子 标记检测法 1 范围 本文件给出了粳稻 （Oryza sativa L. japonica）品种真实性 ，描述了检测方法和结果报告 。 本文件适用于江苏地区推广的粳稻品种的真实性验证和真实性身份鉴定 ，也适用于粳稻常规种 、杂 交种及其亲本的纯度检测 。江苏籼稻品种 （包括常规种 、杂交种及其亲本 ）的真实性和纯度测定可参照 执行。 本文件不适用于粳稻实质性派生品种和转基因品种的鉴定 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，标注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件 ；不标注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于 本文件。 GB/T 39917 —2021 主要农作物品种真实性和纯度 SSR分子标记检测　稻 3 术语和定义 GB/T 39917 —2021界定的术语和定义适用于本文件 。 4 总则 简单序列重复 （SSR）是一类由 2个~6个碱基组成的串联重复 DNA序列。水稻不同品种在 SSR 重复次数上会存在差异 ，这种差异可在世代间稳定遗传 。筛选在品种间重复次数变异丰富的 SSR位点 是利用 SSR分子标记鉴定品种真实性和纯度的关键 。 采用固定数量的 SSR引物对抽取品种的代表性样品 DNA进行扩增和电泳检测 ，并通过与标准样 品比较或与已知品种 SSR指纹数据库比对 ，可对抽样品种的真实性或身份进行鉴定 。筛选能够鉴别品 种群体中异常个体的 SSR引物，进而利用其检测该品种的一定数量个体 ，根据检测到的异常个体数占 比，可对该品种的整体一致性或纯度作出评价 。 中国栽培稻分为籼稻和粳稻两个亚种 ，江苏水稻以粳稻为主 。籼稻和粳稻在基因组组成和生态适应 性上存在明显差异 ，造成一些 SSR位点的重复次数差异在籼稻品种间广泛存在 ，但却不存在于粳稻品种 间。依据江苏粳稻品种间的序列变异特征 ，筛选在品种间变异丰富的 SSR位点，结合 GB/T 39917 — 2021中的 SSR位点和检测流程 ，可提高 SSR标记在江苏粳稻品种真实性和纯度检测中的鉴定效率 。 1DB32/T 4964—2024 5 检测方法 5.1 基本要求 检测平台 、样品要求 、仪器设备 、试剂溶液配制 、检测程序 、DNA提取、PCR扩增、扩增产物分离和数 据分析应符合 GB/T 39917 —2021的规定。 5.2 真实性检测 5.2.1 根据分辨率高 、多态性信息含量值高 、染色体分布均匀 、与GB/T 39917 —2021间的衔接等筛选原 则，本文件确定 76对SSR引物作为江苏粳稻品种真实性鉴定引物 ，其中 48对为 GB/T 39917 —2021中 的引物（编号为 PR01~PR 48） ，另外 28对为新增引物 （编号为 R49~R76）见表 1。 5.2.2 利用 76对引物构建江苏已知粳稻品种及部分杂交籼稻品种的 SSR指纹数据库 。各对引物扩增 的部分代表性带纹和品种见附录 A。 5.2.3 进行品种真实性验证检测时 ，将76对SSR引物分为 Ⅰ组和 Ⅱ组两组依次进行 ，其中 Ⅰ组为 GB/T 39917 —2021中的 48对引物；Ⅱ组为新增的 28对引物。在Ⅰ组引物检测中 ，若检测到可以判定 “否定”结果的差异位点数的 ，终止检测 ；未检测到或检测到但未达到可以判定 “否定”结果的差异位点数 的，应继续完成 Ⅱ组引物的检测 。 5.2.4 进行品种真实性身份鉴定检测时 ，应完成全部 76对引物检测 ，可采用 Ⅰ组和 Ⅱ组序贯方式进行 ， 也可采用其他次序进行 。利用江苏已推广粳稻品种的 SSR指纹数据库 ，通过指纹数据比对筛查确定具 体品种。经比较后与已知品种存在没有位点差异或差异位点数不足而无法得出结论或有争议的 ，允许采 用田间种植鉴定方法等其他方法进行进一步检测鉴定 。 5.3 纯度检测 5.3.1 品种纯度检测所选的引物 ，应通过检测样品预试验 ，从76对SSR引物中筛选出能够准确识别该 样品品种中异常个体的引物 。 5.3.2 异常个体的类型不同 ，所选引物和数目也应不同 。筛选时应结合引物的杂合度 、DNA 快速提取和 多重引物组合电泳的潜力 ，选择合适引物 。 注： 杂交种异常个体主要类型为自交 、异交、混杂；常规种和杂交亲本种子异常个体为异交 、混杂。 5.3.3 筛选结果表明样品在个别位点存在遗传不稳定状况的可将其剔除 ；检测样品存在严重遗传不稳定 状况的可终止纯度测定 。 5.4 引物合成 5.4.1 真实性检测或身份鉴定引物 表1给出了 28对新增的真实性验证或身份鉴定引物 ，其中各引物染色体位置参考的基因组版本号 为Os⁃Nipponbare⁃Reference⁃IRGSP⁃ 1.0。选用 PAGE电泳，只需合成普通引物 ，采用单引物电泳 ；选用 荧光毛细管电泳 ，应在正向引物的 5′端标记荧光染料合成引物 ，采用单引物或组合引物电泳 。 2DB32/T 4964—2024 表1　新增的 28对真实性验证或身份鉴定引物 R49 R50 R51 R52 R53 R54 R55 R56 R57 R58 R59 R60 R61 R62 R63 R64RM1331 RM9 RM3825 ZY24.5⁃2⁃6 RM1358 RM5472 RM218 RM3297 LG25.4⁃3⁃1 XG16.6⁃4⁃1 RM1359 RM3796 RM1115 RM3183 RM7193 RM4121 （1670278） 1 （23326225 ） 1 （36471203 ） 2 （5126573） 2 （10185685 ） 2 （30643072 ） 3 （8406429） 3 （13289444 ） 3 （25378971 ） 4 （15247546 ） 4 （20032557 ） 5 （488187） 5 （14816294 ） 6 （12448177 ） 6 （20258707 ） 6 （30328850 ）55 55 55 55 55 55 55 55 55 55 55 55 55 55 55 55正向：CACCAGCTTCATGCATGC 反向：AGCACTCAACTGATGCAGTG 正向：GGTGCCATTGTCGTCCTC 反向：ACGGCCCTCATCACCTTC 正向：AAAGCCCCCAAAAGCAGTAC 反向：GTGAAACTCTGGGGTGTTCG 正向：CACTCCTACTTCCTCCGTT 反向：AGGCGTGATGTTCTACTGTTA 正向：GATCGATGCAGCAGCATATG 反向：ACGTGTGGCTGCTTTTGC 正向：CACTCAAGACCAGACCTGTACG 反向：CGGCACGTCATTGTAGTGAC 正向：TGGTCAAACCAAGGTCCTTC 反向：GACATACATTCTACCCCCGG 正向：CTCGTACTCCTCTTCCACCG 反向：GTAACCTAGCTGCCCCTTCC