! 7 ,     江苏省市场监督管理局 发　布 中 国 标 准 出 版 社 出　版家兔冷冻精液生产技术规程 Technical code of pratice for the production of frozen semen in rabbits 2024 -04-26 发布 2024 -05-26 实施CCS B 43 DB32/T 4756 —2024ICS 65.020.30DB32/T 4756 —2024 前言…………………………………………………………………………………………………………… Ⅲ 1 范围………………………………………………………………………………………………………… 1 2 规范性引用文件 …………………………………………………………………………………………… 1 3 术语和定义 ………………………………………………………………………………………………… 1 4 精液采集 …………………………………………………………………………………………………… 1 5 冷冻稀释液制备 …………………………………………………………………………………………… 1 6 制作过程 …………………………………………………………………………………………………… 1 7 质量评定 …………………………………………………………………………………………………… 2 8 包装、贮存和运输 …………………………………………………………………………………………… 2 附录 A （资料性）家兔冷冻精液稀释液配制方法 …………………………………………………………… 4 附录 B （资料性）家兔冷冻精液记录表 ……………………………………………………………………… 5 参考文献 ………………………………………………………………………………………………………… 6目　 次 ⅠDB32/T 4756 —2024 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020 《标准化工作导则　第 1部分：标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由江苏省畜牧业标准化技术委员会提出并归口 。 本文件起草单位 ：江苏省农业科学院 。 本文件主要起草人 ：邵乐、秦枫、潘孝青、张霞、翟频、杨杰、李健、董榕、戴钰钰、王爱全、张莉。 ⅢDB32/T 4756 —2024 家兔冷冻精液生产技术规程 1 范围 本文件规定了家兔冷冻精液的精液采集 、冷冻稀释液制备 、制作过程 、质量评定及包装 、贮存和运输 。 本文件适用于家兔的冷冻精液生产 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件 ；不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本 文件。 GB/T 5458 液氮生物容器 NY/T 3185 家兔人工授精技术规程 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 。 4 精液采集 4.1 采精技术 家兔精液采集方法应符合 NY/T 3185的规定。 4.2 新鲜精液质量要求 色泽呈乳白色或灰白色 ，精子活力应不小于 80%，精子密度应不小于 1.5×108 个/mL。 5 冷冻稀释液制备 配制方法参照附录 A，或购买商品冷冻稀释液 。 6 制作过程 6.1 稀释方法 采集好兔精液 ，达到 4.2要求后，应快速放入冰箱 ，在3 ℃~ 5 ℃冷藏 90 min。然后将等温等量的精 液冷冻稀释液缓慢倒入精液中 ，宜边加边轻轻摇晃 ，使冷冻保存稀释液与兔精液充分混合 。 6.2 分装和标识 用于分装精液的是微型细管 ，管内应留一定的空隙 ，两端封口应严密 。细管外壁应清楚标明生产日 1DB32/T 4756 —2024 期、生产站名 、种兔品种和个体号 。 6.3 平衡 应置于 3 ℃~ 5 ℃平衡 45min。 6.4 预冷冻 冷冻用具应洁净后消毒 。平衡后的细管冻精立即转移至铜网或细管架上预冷冻 ，应在液氮液面上方 5 cm处预冷冻 10 min后浸入液氮保存 。 6.5 生产记录 家兔冷冻精液生产记录表参照附录 B的表 B.1。 7 质量评定 7.1 精液复苏 将细管冻精直接置于 37 °C水浴中解冻 10 s，适当摇动 ，使冻精融化 。 7.2 质量要求 精液质量检测应具备显微镜 ，血球计数板 ，电子天平等常用仪器 。家兔细管冷冻精液质量要求应符 合表 1的规定。 表 1　家兔细管冷冻精液质量要求 项目 外观 剂型 /mL 剂量 /mL 精子活力 /% 前进运动精子数 /（104个/剂） 精子畸形率 /% 菌落数 /（个/剂）指标 细管无裂痕 ，两端封口严密 ，标志应清晰 微型，0.25 0.20±0.01 ≥35 ≥500 ≤20 ≤600 7.3 判定规则 正常生产时 ，每三个月检验一次 。每批随机抽取三份用于检验 ，结果以抽检三份样品的平均值为准 。 取样完成后应立即填写样品登记单 。登记表参照表 B.2进行。对照表 1要求，判定每批产品是否合格 。 8 包装、贮存和运输 8.1 包装 冻精应使用专用塑料管分装 ，并由灭菌纱布袋包装 。 2DB32/T 4756 —2024 8.2 贮存 每只公兔的冻精应单独贮存 ，应由专人负责及时补充液氮 ，保证冻精浸没在液氮中 。贮存冻精的低 温容器应符合 GB/T 5458的规定，且每年至少消洗一次并更换新鲜液氮 。 8.3 运输 冻精运输过程中应由专人负责 ，保证冻精始终浸没在液氮中 。贮存容器不应横倒 、碰撞和强烈振动 。 3DB32/T 4756 —2024 附 录 A （资料性 ） 家兔冷冻精液稀释液配制方法 A.1 稀释液配方 三羟甲基氨基甲烷 3.03 g、柠檬酸 1.69 g、葡萄糖 0.85 g、海藻糖 2.05 g、L⁃谷氨酸 0.74 g，二甲基亚砜 16 mL、甘油 3 mL。 A.2 配制方法 配制方法 ：准确称取三羟甲基氨基甲烷 3.03 g、柠檬酸 1.69 g、葡萄糖 0.85 g、海藻糖 2.05 g、L⁃谷氨酸 0.74 g，放入 100 mL容量瓶内 ，加入蒸馏水 50 mL，溶解后定容至 100 mL。然后加入二甲基亚砜 16 mL、 甘油 3 mL，用磁力搅拌器充分搅拌均匀后备用 。 4DB32/T 4756 —2024 附 录 B （资料性 ） 家兔冷冻精液记录表 家兔冷冻精液生产记录表的样式见表 B.1，家兔冷冻精液取样登记表的样式见表 B.2。 表 B.1　家兔冷冻精液生产记录表 生产日期 生产地点 公兔品种 公兔编号 液氮罐编号 操作人 表 B.2　家兔冷冻精液取样登记表 取样日期 取样地点 公兔品种 公兔编号 样品生产日期 取样人 5