! 7 ,     江苏省市场监督管理局 发　布 中 国 标 准 出 版 社 出　版鳜鱼传染性脾肾坏死病诊断及综合防控 技术规程 Technical code of practice for the diagnosis ， prevention ， and control of infectious spleen and kidney necrosis in mandarin fish 2024 -04-03发布 2024 -05-03实施CCS B 52 DB32/T 4727—2024ICS 65.150DB32/T 4727—2024 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第 1部分：标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由江苏省农业农村厅提出 。 本文件由江苏省渔业标准化技术委员会归口 。 本文件起草单位 ：扬州大学 。 本文件主要起草人 ：张晓君、高晓建、姜群、刘晓丹、朱鑫海、姜姿妍、周一凡。 ⅠDB32/T 4727—2024 鳜鱼传染性脾肾坏死病诊断及综合防控 技术规程 1 范围 本文件规定了鳜鱼传染性脾肾坏死病的诊断 、综合防控和记录 。 本文件适用于鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的检测以及鳜鱼传染性脾肾坏死病的诊断和综合防控 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件 ；不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本 文件。 GB 11607　渔业水质标准 SC/T 7103　水生动物产地检疫采样技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 。 4 诊断 4.1 现场调查 水质情况包括水源 、水色、水温、透明度、pH、亚硝酸盐 、氨氮、溶解氧、硬度等；养殖情况包括养殖密 度、苗种来源 、饵料鱼来源等 。 4.2 临床诊断 患病鱼表现为沿池边漫游而死 ，鳃盖、口腔周围 、下颌、胸鳍、腹鳍充血 ，鳃发白，解剖后肝脏呈现白色 或有出血点 ，肾脏和脾脏肿大或有明显的出血点 ，部分胆囊肿大 ，部分幽门盲囊出血 （见附录 A图A.1） 。 4.3 检测方法 4.3.1 试剂材料 试剂材料 ： a)无水乙醇 （分析纯） ； b)三氯甲烷 （分析纯） ； c)异戊醇（分析纯） ； d)1 mmol/L 乙二胺四乙酸 （EDTA） ，pH 8.0； e)1% 十二烷基硫酸钠 （SDS） ； f)ddH 2O； 1DB32/T 4727—2024 g)10 mmol/L Tris⁃HCl ，pH 8.0，4 ℃保存； h)Tris饱和酚，4 ℃保存； i) 8 U/µL Bst DNA 聚合酶，-20 ℃保存； j) 10 mmol/L dNTPs 混合物（dATP、dTTP、dCTP、dGTP各2.5 mmol/L ） ，-20 ℃保存； k)10 000×SYBR Green I ，-20 ℃保存； l)25 mmol/L MgCl 2，-20 ℃保存； m)10×LAMP 缓冲液，-20 ℃保存； n)5 mol/L甜菜碱，-20 ℃保存； o)10×PCR 缓冲液，-20 ℃保存； p)5 U/µL Taq DNA 聚合酶，-20 ℃保存； q)20 mg/mL 蛋白酶 K，-20 ℃保存； r)LAMP检测引物序列 ： F3：5′⁃AACCACCAGGCAGAAATGG⁃ 3′ B3：5′⁃ATCCGAGGCGACGTCATC⁃ 3′ FIP：5′⁃TAAAGCCAAAGCCCACATCGGCGAAGACATGGTGCGCTACT⁃ 3′ BIP：5′⁃AAGCAAGTGCACAGCACCCGTCAAGCCTCGCACAGAGG⁃ 3′ s)巢氏 PCR检测引物序列 ： MCP ⁃F1：5′⁃ATGTCTGCAATCTCAGGT⁃ 3′ MCP ⁃R1：5′⁃TTACAGGATAGGGAAGCCTG⁃ 3′ MCP ⁃F2：5′⁃GCGTTTGATGCGATGGAGAC⁃ 3′ MCP ⁃R2：5′⁃ACGGCAGAGACACGGTAGGC⁃ 3′ 4.3.2 仪器设备 仪器设备包括 ： a）灭菌锅； b）水浴锅； c）PCR仪； d）紫外分光光度计 ； e）电泳仪； f）电泳槽； g）凝胶成像系统 ； h）离心机。 4.3.3 采样 采集样品的数量见 SC/T 7103。鳜鱼体表用 75%酒精消毒后解剖剪解剖 ，无菌操作 ，剪取小块肾 脏、脾脏、肝脏，匀浆后用于 DNA提取。 4.3.4 检测样本模板制备 利用酚 ⁃氯仿（三氯甲烷 ）法抽提混合组织 DNA。每个样品取组织 100 mg~200 mg，匀浆后置于 1.5 mL微量离心管 ，加入含蛋白酶 K的裂解液 （10 mmol/L Tris⁃HCl ，pH 8.0；1 mmol/L EDTA ，pH 8.0； 1% SDS） ，60 ℃消化 1 h~3 h。 用Tris饱和酚∶三氯甲烷 ∶异戊醇（25∶24∶1）混合液提取 、纯化 DNA，-20 ℃冷冻的无水乙醇沉淀 2DB32/T 4727—2024 DNA，自然干燥 ，溶于灭菌 ddH 2O。紫外分光光度计测定 DNA浓度和纯度 ，琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 完整性。DNA样品置于 -20 ℃冰箱保存备用 。 4.3.5 环介导等温扩增 （LAMP）检测方法 4.3.5.1 LAMP扩增 按表 1加入各项试剂进行 LAMP扩增，同时以 ddH 2O为模板作阴性对照 ，以病毒质粒作阳性对照 ， LAMP的反应条件 ：65 ℃保持 60 min，80 ℃终止反应 10 min。 表1　LAMP反应体系 （25 μL） 试剂 DNA模板 内引物（FIP、BIP） 外引物（F3、B3） dNTPs（10 mmol/L ） 10×LAMP 缓冲液 甜菜碱（5 mol/L） MgCl 2（25 mmol/L ） Bst DNA 聚合酶（8 U/µL） ddH 2O体积 µL 2 各1 各1 2.5 2.5 4 2 1 补足至 25 4.3.5.2 LAMP检测结果判断 将1 μL 10 000×SYBR Green I 荧光染料加入 LAMP反应产物 ，振荡后观察混合液颜色 ，绿色为阳 性，橙色为阴性 （见图 A.2） 。 4.3.6 巢式 PCR检测方法 4.3.6.1 PCR扩增 按表 2加入试剂进行第一轮 PCR扩增，同时以 ddH 2O为模板作阴性对照 ，以病毒质粒作阳性对照 ， PCR的反应条件 ：94 ℃预变性 5 min、94 ℃变性 30 s、58 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 1 min，循环 30次后 72 ℃ 延伸 10 min。 表2　第一轮扩增反应体系 （25 μL） 试剂 DNA模板 MCP ⁃F1 MCP ⁃R1 10×PCR 缓冲液体积 μL 1 0.5 0.5 2.5 3DB32/T 4727—2024 表2　第一轮扩增反应体系 （25 μL） (续) 试剂 MgCl 2（25 mmol/L ） dNTPs（10 mmol/L ） Taq DNA 聚合酶（5 U/µL） ddH 2O体积 μL 2 1 0.5 补足至 25 按表 3加入试剂进行第二轮 PCR扩增，以ddH 2O为模板作阴性对照 ，以病毒质粒作阳性对照 ，PCR 的反应条件 ：94 ℃预变性 2 min、94 ℃变性 30 s、55 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 30 s、循环 30次后 72 ℃延伸 10 min。 表3　第二轮扩增反应体系 （25 μL） 试剂 DNA模板（第一轮 PCR扩增产物 ） MCP ⁃F2 MCP ⁃R2 10×PCR 缓冲液 MgCl 2（25 mmol/L ） dNTP（10 mmol/L ） Taq DNA 聚合酶（5 U/µL） ddH 2O体积 μL 1 0.5 0.5 2.5 2 2 0.5 补足至 25 4.3.6.2 巢氏 PCR检测结果判断 反应结束后 ，取5 μL PCR产物，用1% 琼脂糖凝胶进行电泳分析 ，采用凝胶成像系统观察并记录结 果，第一轮阳性扩增片段的大小为 1 362 bp，第二轮阳性扩增片段的大小为 526 bp，阴性无扩增片段 （见 图A.3） 。 4.3.7 综合判定 结合现场调查 、临床症状和分子生物学检测结果 ，诊断结论如下 ： a）有临床症状 ，分子诊断阳性的 ，判定鳜鱼患传染性脾肾坏死病 ； b）无临床症状 ，分子诊断阳性的 ，判定鳜鱼携带传染性脾肾坏死病毒 ； c）无临床症状 ，分子诊断阴性的 ，判定鳜鱼未患传染性脾肾坏死病 。 4DB32/T 4727—2024 5 综合防控 5.1 养殖前准备工作 5.1.1 养殖用水 水源应符合 GB 11607渔业水质标准 。 5.1.2 池塘准备 5.1.2.1 池塘清整 冬季在捕捞后 ，排干池水 ，维修堤埂滩脚 ，并清除池底过多淤泥及池边杂草 ，晒池和冻池 。 5.1.2.2 生石灰清塘 生石灰清塘包括 ： a）干法清塘 ：池塘留水 6 cm~ 9 cm，用10 kg/ 100 m2~30 kg/ 100 m2生石灰清塘 ； b）带水清塘 ：按20 kg/ 100 m3~50 kg/ 100 m3生石灰化浆后全池泼洒 。 5.1.2.3 漂白粉清塘 漂白粉含有效氯 ≥28%。漂白粉清塘包括 ： a）干法清塘 ：用量 1 kg/ 100 m2~3 kg/ 100