SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4781—2017 出口食品和饲料中产志贺毒素大肠 埃希氏菌检测方法 天实时荧光PCR法 Detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli in food and animal feed for exportsReal-time PCR method 行业标准信息服务平台 2017-05-12发布 2017-12-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4781—2017 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人：邵景东、申进玲、封振、王传现、薛峰、郭旸、吴福平、王毅谦、李晓红、祝长青、 肖震、崔思宇。 行业标准信息服务平台 1 SN/T4781—2017 出口食品和饲料中产志贺毒素大肠 埃希氏菌检测方法 实时荧光PCR法 1范围 本标准适用于出口食品和饲料中产志贺毒素大肠埃希氏菌（0157、0104、0111、026、0145和 0103)的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 产志贺毒素大肠埃希氏菌Shigatoxin-producingEscherichia coli；STEC 含有志贺毒素编码基因st的大肠埃希氏菌 3.2 肠出血性大肠埃希氏菌 Shiga toxin-producing Escherichia coli causing the attaching and effacing lesion 同时含有志贺毒素编码基因sta和紧密素编码基因eae的大肠埃希氏菌。 注：这种毒力基因组合常与STEC所引起的严重疾病相关。 3.3 实时荧光PCRrealtimePCR 在PCR反应体系中加入荧光集团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。 3.4 Ct 值cycle threshold 每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数， 4方法提要 对样品中微生物进行增菌培养后提取核酸，采用实时荧光PCR方法对志贺毒素编码基因sta和紧 密素编码基因eae进行检测。若样品中st阳性，继续进行菌株分离；若stx和eae阳性，继续进行O血 1 SN/T 4781—2017 清组编码基因rfbE（O157）、wzr（O104），wbdl（O111）、wzx（O26）、ihp1（O145）和wzr（O103）的检 测。若检测到以上某种O血清组阳性，可先对特异的O血清组菌株富集再进行菌株分离。 5培养基和试剂 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。所有 试剂均用无DNA酶污染的容器分装。 5.1改良胰蛋白陈大豆肉汤（mTSB)：见附录A中A.1。 5.2缓冲蛋白陈水(BPW)：见A.2。 5.3CHROMagar STEC显色培养基：见A.3。 5.4CHROMagarO157显色培养基：见A.4。 5.5改良山梨醇麦康凯（CT-SMAC)琼脂：见A.5。 5.6 三糖铁琼脂（TSI)：见A.6。 5.7TE溶液。 5.8 10%SDS。 5.9 蛋白酶K（20mg/mL）。 5.10 氯化钠（NaCI)：5mol/L和0.7mol/L。 5.11 10% CTAB。 5.12 三氯甲烷。 5.13 异戊醇。 5.14 异丙醇。 5.15 70%乙醇。 5.16 核酸提取试剂盒。 5.17 PCR预混液。 5.18 引物和探针：见附录B。 5.19 诊断分型血清：0157、0104,0111、026、0145和0103混合多价或单因子血清 5.20 API20E生化鉴定试剂条或同类产品。 5.21 GNI+卡或同类产品。 5.22 标记单抗磁珠：抗一0157/0104/O111/026/0145/0103免疫磁珠试剂或同类产品。 信息服务平台 6 仪器和设备 6.1 恒温水浴或加热套装置：100℃。 6.2恒温培养箱：36℃土1℃。 6.3离心机：最大转速13000r/min以上。 6.4天平：量程2kg，感量0.1g。 6.5低温冰箱：-20℃~4℃。 6.6均质器。 6.7涂布棒：直径3mm~4mm。 6.8接种环：直径3mm。 6.9灭菌样品处理器具：取样勺、剪刀、镊子。 2