ICS 65.020.30 CCS B 41 15 内蒙古自治区 地方 标准 DB15/T 4019—2025 马肠道乳酸菌的筛选及鉴定技术规程 Code of practice for screening and identification of lactic acid bacteria in equine gut 2025-04-30发布 2025-05-30实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 4019 —2025 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（ SAM/TC 19 ）归口。 本文件起草单位： 内蒙古农牧业科学院、内蒙古草原御驴科技牧业有限公司、内蒙古农业大学、杭 锦旗农牧技术推广中心、内蒙古医科大学、内蒙古自治区农牧业技术推广中心、内蒙古自治区农畜产品 质量安全中心、乌拉特中旗畜牧和水产服务中心。 本文件主要起草人：苏少锋、吴海青、赵一萍、耿傲盼、李建、张心壮、薄素玲、黄瑶、乔健敏、 高天、白晋宇、张勇伟、陈越、孙培陪、史艳英、罗杰、余彪、聂丽珍、王宇胜、乌仁塔娜、贾军、海 旭冉、刘永、武玉平、郝治华、徐超、郝海忠、周姵诺、王春浩、马晓彤、赵娜。 DB15/T 4019 —2025 1 马肠道乳酸菌的筛选 及鉴定技术 规程 1 范围 本文件规定了马肠道乳酸菌的筛选及鉴定的材料和技术要求。 本文件适用于马肠道乳酸菌的筛选及鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 4789.2 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定 GB 4789.28 -2024 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求 GB 4789.35 -2023 食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验 GB 7300.502 -2023 饲料添加剂 第5部分：微生物 植物乳杆菌 GB/T 38483 微生物源抗生素类次生代谢产物抗细菌活性测定 抑菌圈法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 材料与设备 材料 4.1.1 试验菌株 从马肠道的内容物与黏膜中分离 的乳酸菌。 4.1.2 指示菌株 伤寒沙门氏菌（ Salmonella typhimurium CMCC（B）50071）、大肠埃希氏菌（ Escherichia coli ATCC 25922 ）、金黄色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus CMCC（B）26003）。 仪器设备 实验中用到的仪器设备按照附录 A中A.1执行。 试剂与耗材 4.3.1 试剂 实验中用到的试剂按照附录 A中A.2执行。 DB15/T 4019 —2025 2 试剂质量和培养基制备质量标准按照 GB 4789.28 执行。 4.3.2 耗材 实验中用到的耗材按照附录 A中A.3执行。 溶液配制 按照附录 A中A.4执行。 5 乳酸菌的筛选 乳酸菌的分离、纯化 5.1.1 取样部位 马盲肠、结肠或直肠。 5.1.2 分离方法 5.1.2.1 样品制备按照 GB 4789.35 -2023中6.1.4部分执行。 5.1.2.2 稀释按照 GB 4789.35 -2023中6.2.1和6.2.2部分执行。 5.1.2.3 分别吸取 200 μL10-5 g/mL～10-7 g/mL稀释液， 涂布在 MRS琼脂培养基 （含 有溴甲酚紫） 上， 37 ℃厌氧培养 24 h～36 h，挑取产酸变黄的单菌落进行纯化。 5.1.3 纯化 按照GB 4789.35 -2023中8.1.1部分执行。 复筛 5.2.1 石蕊牛奶显色 使用96孔板，吸取麦氏浊度为 0.5的菌悬液 20 μL于200 µL石蕊牛奶培养基中， 37 ℃厌氧培养 24 h，挑选使培养基呈粉色凝乳状态的菌株。 5.2.2 工作菌液的制备 吸取麦氏浊度为 0.5的菌悬液，以 1 : 10（v : v）加入MRS肉汤培养基中，制备成工作菌液。 5.2.3 产酸性能 吸取工作菌液， 37 ℃厌氧培养，测定 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、16 h、24 h和36 h的pH 值，选择 pH≤4.5的菌株。 5.2.4 生长曲线 吸取工作菌液， 37 ℃厌氧培养，在 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、16 h、24 h和38 h使用酶标 仪测定OD600值，绘制生长曲线。 5.2.5 耐酸性及耐胆盐 DB15/T 4019 —2025 3 5.2.5.1 耐酸性：调节工作菌液 pH=2.0、pH=3.0、pH=4.0，37 ℃厌氧培养，在 0 h、2 h、4 h、6 h、 8 h、12 h、16 h、24 h、32 h、48 h，使用酶标仪测定 OD600值。 5.2.5.2 耐胆盐：调节工作菌液胆盐浓度为 0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L，37 ℃厌氧培养，在 0 h、 2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、16 h、24 h、32 h、48 h，使用酶标仪测定 OD600值。 5.2.6 模拟人工消化液测试 吸取麦氏浊度为 0.5的菌悬液，以 1:10（v:v）分别加入到无菌人工胃液和肠液中， 37 ℃、150 rpm 厌氧培养 2 h。平板计数，按照 GB 4789.2 执行。 5.2.7 耐热试验 吸取麦氏浊度为 0.5的菌悬液，分别置于 37 ℃、42 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃水浴锅中加 热10 min。平板计数，按照 GB 4789.2 执行。 综合以上数据，挑选综合性能最好的菌株进行下一步实验。 安全性评价 5.3.1 溶血性 将麦氏浊度为 0.5的菌悬液均匀地点种或划线接种到哥伦比亚血平板表面， 37 ℃厌氧培养 24 h，观 察是否有溶血现象。溶血试验结果为阴性的，可通过；否则，应放弃使用。 5.3.2 抗生素敏感性 将麦氏浊度为 0.5的菌悬液均匀涂布于 MRS琼脂培养基上，采用纸片扩散法，将抗生素药片（按照附 录A中A.2执行）放置于 MRS琼脂培养基上， 37 ℃厌氧培养 24 h，观察并测量抗菌圈直径大小。 6 乳酸菌的鉴定 形态学鉴定 使用革兰氏染色方法，按照 GB 4789.35 -2023中附录A中A.7部分执行，在显微镜下观察菌株形态并 进行描述分析 。镜下菌体形态多样，呈球状或杆状，无芽孢，革兰氏染色阳性。 生化鉴定 使用乳酸菌成套生化鉴定管，结合《伯杰细菌鉴定手册》（第九版）判定乳酸菌种属。鉴定管成分 按照附录 A中A.2执行。 分子生物学鉴定 按照GB 7300.502 -2023中附录A中A.3部分执行。 抑菌性能 按照GB/T 38483 执行。 指示菌株标准株：伤寒沙门氏菌（ Salmonella typhimur ium CMCC（B）50071）、大肠埃希氏菌 （Escherichia coli ATCC 25922 ）、金黄色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus CMCC（B）26003）。 抗氧化性 DB15/T 4019 —2025 4 6.5.1 细胞外发酵上清液（ EFS）：菌株生长到对数生长期（ OD600约为1.0），4000 rpm 、4 ℃离心 10 min，收集上清液。 6.5.2 完整细胞（ IC）：菌体用 1×PBS溶液（pH=7.4）洗涤，重悬于等体积的 1×PBS溶液中。 6.5.3 细胞内提取物（ ICE）：菌体用 1×PBS溶液洗涤，送入低温超声波破坏（ 400 W，工作时间 5 s， 间隔5 s，80次）、8000 rpm 离心20 min，收集上清液。 6.5.4 以上得到的溶液用于 DPPH自由基清除能力测试。 7 乳酸菌的保藏 可选择使用冻干保藏，超低温（不高于 -70 ℃）冷冻保藏或其他有效的保藏方法。