ICS 65.020.30 CCS B 41 15 内蒙古自治区 地方 标准 DB15/T 3747—2024 羊布鲁氏菌 免疫抗体 (M5-90Δ26株)与 感染抗体鉴别检测 ELISA法 ELISA method for distinguishing m5 -90Δ26 vaccinated antibodies from wild-type brucella Infected antibodies in sheep and goat 2024-11-29发布 2024-12-29实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 3747 —2024 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。 本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（ SAM/TC 19 ）归口。 本文件起草单位：内蒙古自治区动物疫病预防控制中心、内蒙古金迈诗生物科技有限公司。 本文件起草人：郭宇、王建龙、陈君彦、萨茹拉、张璇、高登军、庄金山、王旭红、武琥琮、苏胜 杰、特木尔巴根、马立峰、郝剑锋、陈焱。 DB15/T 3747 —2024 1 羊布鲁氏菌免疫抗体 (M5-90Δ26株)与 感染抗体鉴别检测 ELISA法 1 范围 本文件规定了仅免疫羊布鲁氏菌基因缺失活疫苗（ M5-90Δ26株）免疫抗体与感染抗体鉴别检测 ELISA方法。 本文件适用于仅免疫羊布鲁氏菌基因缺失活疫苗 （ M5-90Δ26株） 免疫抗体与感染抗体的鉴别检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 18646 -2018 动物布鲁氏菌病诊断技术 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ELISA 酶联免疫吸 附试验（ Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ） HRP 辣根过氧化物酶（ Horseradish Peroxidase ） TMB 3,3',5,5' -四甲基联苯胺（ Tetramethylbenzidine ） PBS 磷酸盐缓冲液（ Phosphate Buffered Saline ） OD 光密度（ Optical Density ） PCR 聚合酶链式反应（ Polymerase Chain Reaction ） DNA 脱氧核糖核酸（ Deoxyribonucleicacid ） BCA 聚氰基丙烯酸正丁酯（ Bicinchoninic Acid ） 5 仪器和设备 酶标仪（含有 450 nm滤光片）。 洗板机。 DB15/T 3747 —2024 2 恒温培养箱（ 37 ℃）。 离心机。 冰箱（4 ℃，－20 ℃）。 旋涡振荡器。 可调微量移液器（量程为 1μL～10μL、10μL～100μL、20μL～200μL、30μL～300μL和100 μL～1000μL等）。 6 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯的生化试剂，实验室用水应符合 GB/T 6682 的规定。 包被抗原 按照附录 A中A.1配制。 抗原包被缓冲液 按照附录 A中A.2配制。 PBS（0.01 mol/L ，pH值7.4） 按照附录 A中A.3配制。 封闭液 按照附录 A中A.4配制。 20倍浓缩洗涤液 按照附录 A中A.5配制。 样品稀释液 按照附录 A中A.6配制。 阳性对照 按照附录 A中A.7配制。 阴性对照 按照附录 A中A.8配制。 酶结合物 按照附录 A中A.9配制。 TMB显色液 商品化产品。 终止液 按照附录 A中A.10配制。 96孔酶标板。 血清稀释板。 封板膜。 移液器相匹配的吸头。 商品化试剂盒（可以选择）。 7 样品采集、保存与运输 样品采集 按照NY/T 541 执行，按常规方法采血，采血管室温（ 18 ℃～25 ℃）下倾斜 30°静置2 h～4 h，待 血液凝固有血清析出时，置 4 ℃冰箱过夜，待大部分血清析出即为待检血清，必要时可低速离心（ 1000 r/min离心10 min～15 min），收集血清。样品采集生物安全规范应符合 GB 19489 规定。 样品保存 血清样品若在一周内进行检测，则置于 4 ℃冰箱保存备用。血清样品若超过一周检测，则置于－ 20 ℃保存备用。 样品运输 血清样品若 12 h内运达实验室，在保温箱内加冰袋运输。若超过 12 h后运输，血清样品应先冷冻 （－20 ℃）后，在保温箱内加大量冰袋运输，途中不能超过 48 h，样品的包装和运输应符合农业农村 部《高致病性动物病原微生物菌（毒）种或样本运输包装规范》。 DB15/T 3747 —2024 3 8 检测方法 鉴别检测 ELISA法原理 感染抗体，指若羊感染布鲁氏菌野毒株，则既会产生针对脂多糖 LPS的抗体，也会产生针对膜间质 蛋白BP26的抗体。免疫抗体，指若羊免疫布鲁氏菌基因缺失活疫 苗（M5-90Δ26株）以后，则只产生针 对脂多糖 LPS的抗体。鉴别 ELISA检测方法，通过同时检测羊血清样品中脂多糖 LPS和膜间质蛋白 BP26的 抗体，以鉴别羊布鲁氏菌基因缺失活疫苗（ M5-90Δ26株）免疫抗体和野毒株感染抗体。 试剂平衡 试剂在室温（ 18 ℃～25 ℃）条件下放置至少 30 min，平衡至室温（ 18 ℃～25 ℃）后使用，使用 前充分摇匀。 试剂配制 将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水进行 20倍稀释，即为工作浓度的洗涤液。 稀释 8.4.1 样品稀释 在血清稀释板中，用样品稀释液将待测样品 10倍稀释（ 即90μL样品稀释液中加 入10μL待测样品），充分混匀，备用。 8.4.2 阴性对照和阳性对照稀释 商品化标准阴性血清和阳性血清，分别用样品稀释液 1:50稀释， 充分混匀。置 2 ℃～8 ℃保存备用。 抗原包被 用包被缓冲液将纯化膜间质蛋白 BP26稀释至0.5 μg/mL，将脂多糖 LPS稀释至2 μg/mL，按每孔 100 μL加入96孔酶标板中，标记为膜间质蛋白 BP26和脂多糖 LPS包被板，贴封板膜，置 2 ℃～8 ℃作用16 h～18 h。膜间质蛋白 BP26包被板标记为 B1、B2……，脂多糖 LPS包被板标记为 L1、L2……。按 照附录B 和附录C。 洗涤 弃去孔中液体，每孔加入 300 μL工作浓度洗涤液，洗涤 3次，在最后一次洗涤液弃去后，将孔中残 留的洗涤液在吸水纸上拍干。 封闭 每孔加入 200 μL封闭液，贴封板膜，置 37 ℃恒温培养箱内封闭孵育 3 h±5 min。 洗涤 洗涤方法同 8.6。 加样 8.9.1 加阴阳性对照 在标记脂多糖 LPS包被板和膜间质蛋白 BP26包被板上，分别设阴性对照 2孔 和阳性对照 2孔。即，在脂多糖 LPS包被板的 AL1和AL2孔中，加入阴性对照各 100 μL；在BL1和BL2 孔中，加入阳性对照各 100 μL。在膜间质蛋白 BP26包被板的 AB1和AB2孔中，加入阴性对照各 100 μ L；在BB1和BB2孔中，加入阳性对照各 100 μL。按照附录 B和附录C进行加样。 DB15/T 3747 —2024 4 8.9.2 加样 在标记脂多糖 LPS包被板和膜间质蛋白 BP26包被板的剩余孔（除 AL1、AL2、BL1、BL2、 AB1、AB2、BB1和BB2孔）中，分别先加入 80 μL样品稀释液后，再加入步骤 8.4.1中已稀释好的待检 样品20 μL。按照附录 B和附录C进行加样。 孵育 轻轻振匀孔中样品，盖上封板膜，置 37 ℃恒温培养箱内孵育 30 min±1 min。 洗涤 洗涤方法同 8.6。 加酶结合物 每孔加入 100 μL酶结合物，盖上封板膜。 孵育 置37 ℃恒温培养箱内避光孵育 1 h±5 min。 洗涤 洗涤方法同 8.6。 显色 每孔加入 100 μL TMB显色液，盖上封板膜，置 37℃恒温培养箱内避光孵育 15 min±1 min。 终止 每孔加入 100 μL终止液，终止显色反应。 测定 使用酶标仪测定 450 nm波长处样品和对照的吸光值（ OD450 nm ）。 9 结果判定 试验成立条件 若LPS/LPS＞2.1，且BP26/BP26 ＞2.1时，则判为试验成立。否则，本次试验无效，需重新进行。 注： LPS=（PCLPS1+PCLPS2 ）/2，表示脂多糖 LPS包被板上阳性对照的 OD450 nm 平均值；