ICS 65.020.20 CCS B 23 15 内蒙古自治区 地方标准 DB15/T 3699—2024 马铃薯种质资源离体培养及保存技术规程 Technical code of practice for tissue culture and preservation of potato germplasm resources 2024-10-25发布 2024-11-25实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 3699 —2024 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。 本文件由 内蒙古自治区农业标准化技术委员会 (SAM/TC 20) 归口。 本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院。 本文件主要起草人：曹春梅、逯春杏、王晓娇、许飞、韩艺、张翠玲、胡嘉鑫。 DB15/T 3699 —2024 1 马铃薯种质资源离体培养及保存技术规程 1 范围 本文件规定了马铃薯种质资源离体培养技术规程及保存的茎尖剥离 （脱毒） 材料的选取、 脱毒与培养、 试管苗保存、试管薯诱导等技术要求。 本文件适用于马铃薯种质资源离体培养及保存。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文 件。 NY/T 401 脱毒马铃薯种薯（苗）病毒检测技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 茎尖剥离 apical stripping 应用茎尖分生组织培养技术，选取马铃薯芽顶端部分（直径 0.1 mm～0.3 mm），带有 1～2个叶原基的 茎尖分生组织，移植到诱导培养基中培养。 离体培养 isolated culture 选取马铃薯茎尖、茎段或其他离体组织通过无菌操作接种在特定的培养基上，在人工控制条件下进行 培养，已获得的完整植株可保持其体内所含遗传物质的完整性，从而达到保存目的的方法。 4 茎尖剥离（脱毒）材料的选取 选取无类病毒 (PSTVd)、健壮且具备马铃薯品种（系）典型农艺性状植株的顶芽、腋芽或健康块茎的茎 尖作为材料。 5 脱毒与培养 脱毒材料的预处理 收获脱毒材料，将块茎放置在温室或培养箱内进行催芽处理。待芽萌发 2 cm时，在温度 35 ℃~37 ℃ 进行高温钝化处理 15 d，光照/黑暗12 h，光照强度 2000 Lx。 DB15/T 3699 —2024 2 培养基的制备 选用MS+0.5 mg/L 萘乙酸+ 0.1 mg/L 6 -苄氨基腺嘌呤或 MS+0.2 mg/L 萘乙酸配方配制培养基，培养基 pH值调至5.8~6.0。分装后在 121 ℃条件下，灭菌 25 min ~30 min，待培养基冷却凝固，观测 24 h，确保无 菌后备用。 脱毒材料的消毒处理 5.3.1 取材 选取经处理的马铃薯块茎上顶芽或侧芽组织 2 cm左右，或选取经处理的马铃薯植株顶芽、腋芽 2 cm左 右作为脱毒材料。 5.3.2 清洗 将选取的脱毒材料放入玻璃烧杯内，放在水龙头下，采用小水流，用毛刷轻刷尘土，随后在烧杯上扎 块纱布，置于流动的小水流下冲洗时间 30 min。 5.3.3 消毒 在超净工作台内， 将脱毒材料放置在灭菌的烧杯内， 先用 75%的酒精浸泡 30 s， 随后用无菌水冲洗 3遍， 控干水分后再用 5%漂白粉溶液或 10%次氯酸钠溶液中浸泡 5 min ~10 min；最后用无菌水冲洗 3遍，滤干水分 备用。 茎尖剥离与接种 解剖镜下，用无菌解剖针或手术刀剥取带有 1~2个叶原基的茎尖分生组织，剥离后的茎尖分生组织直 径0.1 mm ~0.3 mm，接种到灭菌的培养基中进行培养，培养瓶或试管外壁写好编号和日期。 茎尖培养条件 光照培养 14 h，保持24 ℃，光照强度 1500 Lx ~2000 Lx，暗培养 10 h，保持18 ℃。 茎尖成苗 待愈伤分化成苗后， 及时剪出生长点， 转移到 MS培养基上。 待植株生长到 3~4个叶片时， 单节切断快繁， 同时标明该种质资源品种（系）名称、日 期等信息，常规培养。 病毒检测 按照NY/T 401 对扩繁苗进行 PVX、PVY、PVS、PVA、PVM、PLRV病毒检测。 6 试管苗保存 保存培养基配方 MS+20 g/L 甘露醇， pH值5.8~6.0。 保存条件 将用保存培养基扩繁的试管苗置于温度 22 ℃~24 ℃、光照强度 2000 Lx ~3000 Lx、光照时间 16 h/d 条件下培养 2 w，待生根后将培养温度调为 8 ℃~10 ℃、光照时间 12 h/d、光照强度 2000 Lx ~3000 Lx，持 续培养。建议每隔 3个月进行继代培养。 DB15/T 3699 —2024 3 采用紫外线、 熏蒸法， 每隔 10 d对培养室进行一次消毒， 及时取出污染的试管苗并进行高温灭菌处理。 7 试管薯诱导 诱导培养基配方 MS+100 g/L 蔗糖+4.5 g/L 琼脂粉+1 g/L活性炭， pH值为5.8~6.0。 诱导条件 将正常培养 4 w的试管苗置于温度 17 ℃~18 ℃、 光照时间 8 h/d、 光照强度 1000 Lx， 进行试管薯诱导， 60 d后可形成试管薯。 试管薯保存 将试管薯置于 4 ℃～6 ℃，保持恒温，湿度 80%～85%。