ICS 65.020.01 CCS B 38 15 内蒙古自治区 地方标准 DB15/T 3689 —2024 荒漠肉苁蓉愈伤组织生产技术规程 Code of peactice of callus production for Cistanche deserticola Ma 2024-10-25发布 2024-11-25实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 3689 —2024 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 本文件由内蒙古自治区卫生健康委员会提出。 本文件由内蒙古自治区中药材（蒙药材）种植标准化技术委员会（ SAM/TC 54 ）归口。 本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古医科大学附属医院。 本文件主要起草人： 何江峰、王力伟、赵杰、安江红、房永雨、赵小庆、孙华、赵梦然、刘红葵。 DB15/T 3689 —2024 1 荒漠肉苁蓉愈伤组织生产技术规程 1 范围 本文件规定了荒漠肉苁蓉的外植体采集、预处理、培养基配制、愈伤组织诱导及继代培养的方法。 本文件适用于荒漠肉苁蓉愈伤组织的生产。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文 件。 GB/T 603 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 DB15/T 1940 西部沙樱组织培养技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 荒漠肉苁蓉 Cistanche deserticola Y.C.Ma 列当科肉苁蓉属多年生的根寄生草本。 4 材料准备 4.1 材料选择 材料为寄生于梭梭（ Haloxylon ammodendron （C. A. Mey. ）Bunge）根部的无病害、健壮的荒漠肉苁 蓉带鳞叶的肉质茎。 4.2 材料采集 4.2.1 采集时间 春季苗刚出土时或冬季冻土之前采挖。 4.2.2 采集地点 内蒙古阿拉善盟的梭梭林。 DB15/T 3689 —2024 2 4.2.3 采集部位 采集地下部分 ，外观要求表皮及鳞片状叶呈乳白色。 4.2.4 保藏方法 将采集部位埋进沙土中或 放入保鲜袋，在 4 ℃条件下保存 ，保持表面干燥 ，1个月内处理。 5 试剂配制 5.1 器皿灭菌 按照DB 15/T 1940 执行。 5.2 培养基配方 Murashige and Skoog （MS）培养基为基础培养基，添加 2,4-二氯苯氧乙酸（ 2,4-D）2.0 mg/L ，赤霉 素（GA3）1.0 mg/L ，聚乙烯吡咯烷酮（ PVP）2.0 g/L，6-糠氨基嘌呤（ KT）0.5 mg/L ，蔗糖30.0 g/L ，琼 脂7.0 g/L。 5.3 培养基配制 5.3.1 试剂配制 要求 试剂配制按照 GB/T 603 规定方法配制，所用水执行 GB/T 6682 的规定。 5.3.2 1 M KOH溶液的配制 精确称取 28.0 g KOH 粉末，用蒸馏水溶解，冷却至室温后，定容至 500 mL，现用现配。 5.3.3 1 M HCl溶液的配制 精确量取 43.86 mL 的市售38%盐酸，加蒸馏水，定容至 500 mL，现用现配。 5.3.4 2,4-D母液（2.0 mg/mL ）的配制 精确称取2,4-D粉末0.2 g，加1.0 mL 1 M KOH 溶液，于 90 ℃水浴加热助溶，冷却至室温后，用蒸馏 水定容至 100 mL。将配制好的母液经 0.22 μm过滤灭菌器灭菌至 100 mL无菌试剂瓶中，放 4 ℃冰箱，现用 现配。 5.3.5 GA3母液（1.0 mg/mL ）的配制 精确称取 0.1 g GA 3粉末，加 300 μL无水乙醇助溶，用蒸馏水定容至 100 mL。将配制好的母液经 0.22 μm过滤灭菌器灭菌至 100 mL无菌试剂瓶中，放 4 ℃冰箱，现用现配。 5.3.6 KT母液（1.0 mg/mL ）的配制 精确称取KT粉末0.1 g，加1.0 mL 1 M KOH 溶液助溶，用蒸馏水定容至 100 mL。将配制好的母液经 0.22 μm过滤灭菌器灭菌至 100 mL无菌试剂瓶中，放 4 ℃冰箱，现用现配。 DB15/T 3689 —2024 3 5.3.7 1%次氯酸钠溶液的配制 精确量取 100 mL次氯酸钠溶液（分析纯，有效氯 10%），用蒸馏水定容至 1 L，现用现配。 5.3.8 培养基配制 精确称取 4.74 g MS 培养基粉末， 30 g蔗糖，7.0 g琼脂粉， 2.0 g PVP 粉末，于 800 mL蒸馏水中进行 溶解，用 1 M的KOH或HCl将pH值调至5.8，定容至 1 L。在压力 1.1 kg/cm2，温度121 ℃条件下，灭菌 30 min。 待温度降至 50 ℃左右，添加 2 mL 2,4 -D溶液，1 mL GA3溶液和500 μL的KT溶液。 5.3.9 培养基分装 在超净工作台里将配制好的培养基分装在 150 mL的无菌三角瓶中，分装量是三角瓶容量的 1/5～1/4， 分装后用无菌封口膜密封。 5.3.10 培养基保存 分装后的培养基保存于干燥、洁净的储藏室或超净工作台内， 1周之内使用。 5.4 组织培养流程 5.4.1 材料消毒 先用自来水冲洗材料，置于体积适宜的玻璃器皿中。用蒸馏水浸没 30 min，放置于超净工作台上，用 75%乙醇浸没消毒 20 s后无菌水冲洗 3次，再用 1%次氯酸钠溶液浸没 5 min，无菌水冲洗 5次，用无菌滤纸吸 干表面水分。 5.4.2 诱导愈伤组织 5.4.2.1 接种 在超净工作台内剥离获取材料的维管组织， 将其切成 0.3 cm×0.3 cm×0.3 cm的小方块， 作为外植体， 斜插接种到培养基上，每个接种瓶接种 5～6块，深浅适中，分布均匀，封好瓶口。标注接种信息。定期记 录生长情况，检查是否有污染。 5.4.2.2 培养条件 将接种好的培养瓶放置在条件适宜的培养架上，培养温度为 25±1 ℃，暗培养。 5.4.2.3 培养管理 外植体培养 20 d左右开始膨大， 35 d左右形成愈伤组织。培养过程中如有污染，及时处理。 5.4.3 继代培养 5.4.3.1 接种 将外植体诱导的愈伤组织切成 0.3 cm×0.3 cm×0.3 cm的小块，接种到培养基上，每个接种瓶接种 5～ 6块，深浅适中，分布均匀，封好瓶口。标注接种信息。定期记录生长情况，检查是否有污染。 5.4.3.2 培养条件 培养温度为 25±1 ℃，采用 LED全光谱植物生长灯进行补光，光照强度为 1500 Lux～2000 Lux ，光照 时间为10 h光照/14 h黑暗。 DB15/T 3689 —2024 4 5.4.3.3 继代周期 15 d左右可继代一次，继代培养 2～3次，直至获得颗粒状、淡黄色、生长旺盛的愈伤组织。 ____________________