ICS 65.020.01 CCS B 16 15 内蒙古自治区 地方 标准 DB15/T 3641—2024 马铃薯腐烂茎线虫分离、鉴定及培养 技术规程 Technical code of practice for isolation, identification and culture of potato rot nematode disease 2024-08-20发布 2024-09-20实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 3641 —2024 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。 本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会（ SAM/TC 20 ）归口。 本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古自治区植保植检中心、内蒙古农业大学、鄂 托克前旗农牧业技术推广中心、鄂尔多斯市农牧技术推广中心。 本文件主要起草人：霍宏丽、融晓君、席先梅、萨其仍贵、李正男、张冬梅、张溪、路奇、苗春乐、 纪永祥、尤俊文、陈文晋、张磊、孙平平、张朋飞、王欣、高健、孙佳颖、聂利珍、田晓燕、苏雅杰、 杨帆、韩平安、范雅芳、云晓鹏。 DB15/T 3641 —2024 1 马铃薯腐烂茎线虫分离、鉴定及培养技术 规程 1 范围 本文件规定了所用试剂、培养基及引物序列、样品采集及分离、鉴定、培养和样品保存与处理技 术 要求。 本文件适用于马铃薯种植区土壤和马铃薯块茎中的腐烂茎线虫的分离鉴定与培养。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 29577 腐烂茎线虫检疫鉴定方法 NY/T 1121.1 土壤检测 第1部分：土壤样品的采集、处理和贮存 SN/T 1132 松材线虫检疫鉴定方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 马铃薯腐烂茎线虫病 potato rot nematode disease 由马铃薯腐烂茎线虫引起的植物检疫性病害，可导致马铃薯植株叶片黄化、萎蔫，块茎表皮皲裂、 干腐等症状，导致马铃薯产量和品质降低。 4 试剂、培养基及引物序列 试剂和培养基 葡萄糖、 琼 脂、0.5%的次氯酸钠、 0.5%青霉素、0.5%硫酸链霉素、 4%甲醛溶液、 10×Buffer(mg2+) 、 1 mg/mL蛋白酶K，2×Taq PCR MasterMix 、50×TAE、核酸染料、 DL2000 DNA Marker 。 马铃薯葡萄糖琼脂（ PDA）培养基。 引物序列 引物序列按照 GB/T 29577 的要求。 5 样品采集及分离 采集 DB15/T 3641 —2024 2 土壤样品采集应符合 NY/T 1121.1 的规定。取样深度应在 15 cm～20 cm之间，且每份土样重量以 500 g～1000 g为宜。 马铃薯块茎采集方法：收集有腐烂茎线虫病症的马铃薯薯块（见附录 A）。 分离 将土壤称取 50 g、块茎切成 1 cm的小块，采用改进贝尔曼漏斗法进行分离，应符合 SN/T 1132 的规 定。 将分离得到的线虫置于显微镜观察，初步挑选出带有口针的寄生性线虫。 玻片制备 于65 ℃水浴锅中处理 3 min，热杀死线虫后，用 4%甲醛进行固定，制成临时玻片备用。 6 鉴定 形态学鉴定 使用上述制备好的临时玻片，每个样品各选取 20条雌雄虫进行测量，主要测量线虫体长（ L）、体 宽（W）、口针长度（ Stylet）、尾长（ tail）、线虫体 长与最大体宽之比（ a）、线虫体长与体前部至 肠前端的距离之比（ b）、线虫体长与其尾长比（ c）、体前端至阴门的距离× 100/体长（V）。显微镜 观察，初步明确是否为马铃薯腐烂茎线虫（见附录 B）。 分子生物学鉴定 DNA提取：将线虫放入 ddH2O清洗，挑取单条线虫放入 200 µL PCR管中（含 8 µL ddH2O和1 µL 10× PCR Buffer ），液氮中放置 1 min，85 ℃加热2 min，向PCR管中加入 1 µL 1 mg/mL 蛋白酶K，56 ℃加热 15 min，95 ℃加热10 min，得到DNA提取液， -20 ℃保存。 以DNA为模板，进行 PCR反应，反应体系见表 1。 表1 PCR反应体系（ 20 µL） 2×Taq PCR MasterMix 10 µL F（10 μM） 1 µL R（10 μM） 1 µL DNA模板 1 µL ddH2O 补至20 µL 腐烂茎线虫 PCR反应体系如表所示。反应条件为： 95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min共30个循环； 72 ℃ 5 min，4 ℃保存。 将PCR产物送至上海生工测序。测序结果在 NCBI中进行BLAST比较，用 DNAMAN 8.0.8.789 软件进行序 列比对分析，从 NCBI GenBank 数据库中根据 E-score的高低排序，下载同源性较高的部分马铃薯腐烂茎 线虫ITS序列，之后使用 MEGA 7.0.26 软件构建系统发育树。 DB15/T 3641 —2024 3 7 培养 真菌培养 在PDA培养基平板上纯化链格孢菌（ Alternaria tenuis ）和茄腐镰刀菌（ Fusarium solani ），之 后接入1000条马铃薯腐烂茎线虫， 25 ℃暗培养 30 d，可获得大量马铃薯腐烂茎线虫虫体。 薯块培养 线虫悬浮液制备：将分离得到的线虫用 0.5%次氯酸钠溶液消毒 1 min后，3000 r/min 离心2 min,弃 上清液；加入 0.5%硫酸链霉素和 0.5%青霉素的混合液中消毒 10 min，离心后弃上清液，用无菌水冲洗 3 次，线虫悬浮液（约 1000 条/mL），4 ℃保存备用。 腐烂茎线虫培养扩繁：将健康 马铃薯薯块用流动水冲洗、去芽去泥， 75%酒精表面消毒。用灭菌的 打孔器在薯块中央打孔；每个孔内接入线虫约 500条，将取下的薯块组织塞回原处，石蜡封口。接种后 置于25 ℃培养箱中进行暗培养， 40 d后进行马铃薯腐烂茎线虫的分离，于 4 ℃保存备用。 8 样品保存与处理 对检出马铃薯腐烂茎线虫的土壤及块茎样品可保存于 4 ℃冰箱6个月，以备后续研究和生产需要。 保存或培养菌株后的 PDA培养基及玻璃器皿应经高压蒸汽灭菌后方可清洗和处理，使其达到对环境的无 害化方可处理。 DB15/T 3641 —2024 4 A A 附录 A （资料性） 马铃薯腐烂茎线虫病危害症状及发生规律 马铃薯腐烂茎线虫病危 害症状及发生规律见表 A.1。 表A.1 马铃薯腐烂茎线虫病危害症状及发生规律 名称 危害症状 发生规律 马铃薯腐烂茎线虫病 线虫可从匍匐茎或块茎的皮孔和薯 眼等处入侵薯块， 导致马铃薯幼苗矮化、 加粗和分支。 整体长势偏弱， 同时叶片会 出现变淡发黄症状。线虫侵染马铃薯薯 块初期形成侵染点， 薯块表皮呈浅灰色， 表皮易脱落， 随着线虫在薯内聚集， 侵染 部位会逐渐扩大， 颜色呈灰褐色， 到了后 期病变组织变干或海绵状表现为干腐或 湿腐， 表皮皱缩、 凹陷、 龟裂， 呈暗黑色， 线虫在侵染块茎的病健交界处繁殖，同 时会加重细菌、 真菌和螨类复合侵染， 导 致整薯腐烂变质。 以卵、幼虫和成虫寄生马铃薯的块 茎以及根部在窖中越冬，同时幼虫和成 虫在块茎、 土壤和肥料中越冬， 在土壤中 可存活5～6年。 线虫在5 ℃～34 ℃条件下均能发 育、繁殖， 20 ℃～27 ℃为最适宜的繁 殖温度，在 27 ℃～28 ℃下，完成一代 需要18 d；20 ℃～24 ℃下则需 20 d～ 26 d；6 ℃～10 ℃下需68 d。 通过被侵染的植物的地下器官如根 茎、 鳞茎、 块茎等以及粘附在这些器官上 的土壤进行传播，在田间还可以通过农 事操作和流水进行传播。