ICS 65.020.30 CCS B 44 15 内蒙古自治区 地方 标准 DB15/T 3551—2024 呼伦贝尔羊种质资源冷冻保存技术规程 Technical code of germplasm resources cryopreservation on Hulunbeier sheep 2024-07-15发布 2024-08-15实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 3551 —2024 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会 （SAM/TC 19 ）归口。 本文件起草单位：中国科学院东北地理与农业生态研究所、吉林农业大学、内蒙古自治区农牧业科 学院、中国科学院西北高原生物研究所、赤峰学院。 本文件主要起草人：房义、薛树媛、杨其恩、李九月、莫显红、贾功雪、冯春涛、钟荣珍、郭晓飞、 毕江华。 DB15/T 3551 —2024 1 呼伦贝尔羊种质资源冷冻保存技术 规程 1 范围 本文件规定了呼伦贝尔羊精液、卵母细胞和胚胎的冷冻解冻液制备、低温平衡、冷冻、贮存及解冻 技术要点。 本文件适用于呼伦贝尔羊精液、卵母细胞和胚胎的冷冻保存。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 26613 呼伦贝尔羊 NY/T 1674 牛羊胚胎质量检测技术规程 DB15/T 1769 绵羊冷冻精液 DB15/T 3401 奶绵羊胚胎冷冻解冻技术规程 3 术语和定义 GB/T 26613 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 开放式拉长细管 open pulled straw 卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻保存的容器。 胚胎保存液 holding 用于胚胎体外发育的一种商品化溶液。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BSA：牛血清白蛋白 （Bovine Serum Albumin ） COCs：卵丘卵母细胞复合体 （Cumulus-Oocyte Complexes ） DMSO：二甲基亚砜 （Dimethyl Sulfoxide ） EG：乙二醇 （Ethylene Glycol ） FBS：胎牛血清 （Fetal Bovine Serum ） OPS：开放式拉长细管 （Open Pulled Straw ） DB15/T 3551 —2024 2 PBS：磷酸盐缓冲液 （Phosphate Buffered Solution ） TS：玻璃化解冻液 （Thawing Solution ） VS：玻璃化冷冻液 （Vitrified Solution ） 5 精液冷冻保存 冷冻稀释液配制 按照附录 A中表A.1规定的配方配制。 标记 按照DB15/T 1769 的规定执行。 精液要求 精子活力≥ 70%、密度≥ 0.8×109个/mL、畸形率≤ 15%，颜色为乳白色。 精液处理 原精液用 PBS稀释5倍，缓慢搅拌，孵育 5 min，以600 rpm离心10 min，移除上清液。 稀释和平衡 离心处理后的精子，用 I液稀释至 2×108个/毫升，在 4 ℃冰箱平衡 2 h后，再用等体积 II液稀释至 1 ×108个/毫升，再平衡 1.5 h。 装管 在4 ℃条件下，将精液分装到 0.25 mL细管中，另一端封口。 冷冻 5.7.1 程序化冷冻 利用程序冷冻仪，在 4 ℃～-35 ℃温区，设置 6 ℃/min的降温速率；在 -35 ℃～-100 ℃的温区， 设置20 ℃/min的降温速率，然后投入液氮。 5.7.2 熏蒸冷冻 将液氮倒入深度 50 cm以上的泡沫箱预冷 10 min，细管铺放在支架后放入泡沫箱，支架平面距离液 氮面4 cm，熏蒸7 min，然后投入液氮。 贮存 冻精细管以 25支或50支包装单位投入液氮罐。 解冻 取出冻精细管，室温空气浴 5 s，然后放置于 40 ℃水浴10 s取出，无菌纸巾擦干备用。 6 卵母细胞冷冻保存 DB15/T 3551 —2024 3 冷冻方法 OPS法。 卵母细胞选择 挑选至少有 3层卵丘颗粒细胞的 COCs，体外成熟 24 h后，在含 0.1%（w/v）透明质酸酶中消化，去除 卵丘颗粒细胞，挑选胞质均匀、折光性好、排出第一极体的裸卵。 试剂与溶液 按照附录 A中表A.2规定的配方配制。 冷冻 6.4.1 OPS制备 将0.25 mL细管加热变软后拉成为管壁内径为 0.2 mm，管壁厚 0.02 mm的OPS管，冷却后用手术刀片 在其细端切开，细端长度约 2 cm。 6.4.2 冻前准备 玻璃化冷冻液及使用器材在室温 25 ℃至少预热 30 min，在培养皿中制作 100μL～200 μL的VS1和 VS2液滴。保温杯倒入液氮， 15 ml离心管壁扎眼儿、贴标签、记录羊只信息、卵母细胞质量和数量、日 期等，放入保温杯中，用于 OPS的收集。 6.4.3 冷冻 将卵母细胞在 VS1液中平衡 30 s，再移入 VS2液中平衡不超过 25 s，将多枚卵母细胞及少量 VS2吸入 OPS中，投入液氮保存。 解冻 6.5.1 准备 解冻液及使用器材在室温 25 ℃至少预热 30 min。在一个培养皿中加入 2 ml的TS1液，在另一个培养 皿中分别制作 200 μL TS1、TS2、TS3解冻液微滴，置于 37 ℃恒温台上，至少预热 10 min。 6.5.2 解冻 取出OPS， 迅速插入盛有 TS1的培养皿中， 排出卵母细胞并计时。 将卵母细胞移入 TS1微滴孵育 1 min， 然后移入 TS2微滴孵育 5 min，再移入 TS3微滴孵育 5 min，将卵母细胞在培养液中洗涤 3～5次，置于二氧 化碳培养箱中复苏 0.5 h～2 h，备用。 7 胚胎冷冻保存 冷冻方法 程序冷冻仪法。 胚胎选择 选择1、2级桑葚胚至扩张囊胚，胚胎质量鉴定按照 NY/T 1674 的规定执行。 DB15/T 3551 —2024 4 溶液配置 按照附录 A中表A.3规定的配方配制。 标记 按照DB15/T 3401 的规定执行。 胚胎回收 回收到装有 胚胎保存液 并编号的平皿中。 洗涤 胚胎在胚胎保存液 滴中洗4次，放入做好标记的平皿中， 30 min内必须开始冷冻。 平衡 胚胎在S1和S2液中平衡 5 min，在1.5M乙二醇中平衡 10 min。 冷冻 按照DB15/T 3401 的规定执行 。 贮存 将细管装入相应的拇指管内，放入液氮罐中保存。 解冻 胚胎细管从液氮中取出，空气浴 2 s～3 s后，放入 32 ℃水浴10 s。把胚胎放入 T液中平衡 5 min， 然后把胚胎移入 胚胎保存液 平衡5 min，并洗3次，备用。