SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4662—2016 水貂病毒性肠炎检疫技术规范 Quarantineprotocol for minkviral enteritis 行业标准信息服务平台 2016-12-12发布 2017-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4662—2016 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中国农业科学院特产研究所、吉林农业 大学、吉林省中韩动物科学研究院 本标准主要起草人：贾赞、刘钊、颜怀玉、王全凯、闫喜军、徐超、张雪、孙晓飞、胡传伟、袁文泽。 行业标准信息服务平台 1 SN/T4662—2016 水貂病毒性肠炎检疫技术规范 1范围 本标准规定了水貂病毒性肠炎的病毒分离鉴定、琼脂免疫扩散试验（AGID）、对流免疫电泳 （CIEP）、聚合酶链式反应（PCR）等诊断技术 本标准适用于水貂病毒性肠炎的检疫、监测及流行病学调查 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CPE：细胞病变（Cytopathiceffect) CRFK：猫肾传代细胞（CrandelFelineKidneyCells） MEV：水貂肠炎细小病毒（Minkenteritisparvovirus) 4临床诊断 4.1临床特征 生病初期水貂精神沉郁，食欲下降或废绝，渴欲明显增强，体温升高达40℃以上。胃肠病变症状明 显，呕吐出黄绿色的水样或稀粥样物，腹泻，排出稀软到水样或脓样粪便，之后可见便中带血，黏膜脱落 物和未消化的饲料残渣、黏液及大量气泡，有的混有血丝或血凝块。最具特征性的与一般下痫不同的是 粪便中有一种多为灰白色，有时为淡黄色或粉红色、无光泽、肉样感的中空管状物，称黏液管或黏膜圆 柱，它是由脱落肠黏膜、纤维蛋白和肠黏液组成的。本病区别于其他肠炎的另一特点是在发病高峰期， 群貂粪便呈多种多样的颜色，如粉红、鲜红、暗红、黑红、草绿、深绿、淡黄、橘黄、深黄、浅灰和深灰色等。 其他参见附录A。 4.2病理变化 主要在胃肠道表现明显，小肠黏膜呈纤维蛋白性、坏死性、出血性炎症。肠管极度扩张达正常时的 1倍～2倍，管壁很薄近于透明，尤其以空肠、回肠最为严重。肠腔内充满气体或稀薄内容物。因出血时 间长短可见肠外观为鲜红色或暗红、黑红色，内容物为红色或黑褐色酱油状。有的病例大肠黏膜可见条 状出血，肠内容物含大量暗红色或黄绿色黏稠的纤维素性物质。亚急性和慢性病例的肠壁有纤维素性 出血。有的病例胃壁有多处溃疡。胆囊扩张显著，充满黄绿色或黑绿色黏稠胆汁。肝肿大，质地脆弱， 多呈暗红色。有的病例脾、肾肿大，有坏死灶。心外膜有出血点，心肌松软变性 1 SN/T 4662—2016 4.3判定 根据4.1临床检查可作出初步判定。确诊需进行实验室诊断 5实验室诊断 5.1病毒的分离鉴定 5.1.1设备、试剂与材料 5.1.1.1设备 生物安全柜、CO2培养箱、倒置显微镜、高速冷冻离心机、组织匀浆器、细胞培养瓶。 5.1.1.2试剂与材料 除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，试验用水应符合GB/T6682的规定。 血清、猫肾传代细胞（CRFK）。 5.1.2病料采集与处理 5.1.2.1组织脏器的采集与处理 无菌取病、死貂的肾、脾、胸腺、小肠细膜淋巴结等组织脏器，按质量比体积1：10的比例用不含特 牛血清的DMEM培养液制成匀浆，反复冻融3次，3000r/min离心30min，取上清液经0.22μm微孔 滤膜过滤，加人抗菌素至终浓度为青霉素200IU/mL，链霉素200ug/mL，冷藏备用 5.1.2.2粪便、血清及全血样品采集与处理 取粪便按质量比体积1：10的比例用不含犊牛血清的DMEM培养液制成悬液，然后12000r/min 离心30min，取上清液经0.22um微孔滤膜过滤，加入抗菌素至终浓度为青霉素2000IU/mL，链霉素 2000μg/mL，冷藏备用。 无菌采取发病动物全血加入柠檬酸钠抗凝剂，无菌采取全血并分离血清，加入抗菌素至终浓度为 青霉素200IU/mL，链霉素200μg/ml.冷藏备用。 5.1.3病料接种 当CRFK细胞单层铺满80%时，弃去细胞培养液，用无血清细胞培养液冲洗细胞单层后，0.5%胰 酶消化，进行细胞传代，一瓶传3瓶，传代后12h后，将上述处理过的样品接种于刚贴壁的CRFK细胞， 接种量为培养液量的5%，37℃恒温培养箱中吸附1h～2h，倾去多余液体并用无血清细胞培养液冲洗 一次，加人含10%新生特牛血清（经过56℃水浴灭活30min）的DMEM培养液，置37℃的5%CO，恒 温培养箱中培养4d～6d，在此期间换用2%DMEM维持液。同时设正常细胞对照。 5.1.4观察结果 接种24h后置显微镜下观察，以后每隔24h观察一次。如果正常细胞对照成立，接种病料的细胞 出现细胞变圆、拉网、脱落等细胞病变，则立即收获细胞培养物，放入一70℃冰箱中待鉴定。 如果对照细胞与接种样品细胞均无变化，应盲传3代，必要时可增加传代次数， 如果盲传过程中出现细胞病变，按上述原则，收获细胞培养物，放人一70℃冰箱中待鉴定；若盲传 2代未出现细胞病变，则按未分离到水貂肠炎病毒出具结果。 2