ICS 65.020.01 CCS B 05 15 内蒙古自治区 地方 标准 DB15/T 3451—2024 油莎豆根际土壤中假单胞菌分离 鉴定技术规程 Technical code of practice for identification of pseudomonas spp. isolated from rhizosphere soil of Cyperus esculentus 2024-06-14发布 2024-07-14实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 3451 —2024 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。 本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会（ SAM/TC 20 ）归口。 本文件起草单位：内蒙古大学、内蒙古自治区农牧业科学院。 本文件主要起草人：旭日花、张德健、李娟、路战远、叶君、侯智惠、张向前、谢宇、陈文静、李 梁、任永峰、赵小庆、陈立宇、王建国、贾赛红、张立华、胡可欣、萨茹拉、韩淑娟、武玲鑫、张宇佳、 李子南、韩畅、郭茄。 DB15/T 3451 —2024 1 油莎豆根际土壤中假单胞菌分离鉴定技术 规程 1 范围 本文件规定了油莎豆根际土壤中假单胞菌的菌株分离、菌株鉴定以及结果判定 等技术内容要求。 本文件适用于油莎豆根际土壤中假单胞菌的分离鉴定，也可适用于其它植物根际土壤中假单胞菌 的分离鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 8538 食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法 SN/T 4624.17 入境环保用微生物菌剂检测方法 第17部分：恶臭假单胞菌 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 根际土 rhizosphere soil 受植物根系活动的影响， 在物理、 化学和生物性质上不同于土体的距离根系表面数毫米的土壤区域。 4 菌株分离 培养基配制 首先配制 CN培养基，配方及制法依据 GB/T 6682 中的规定执行，实验用水应符合 GB 8538的规定。按 照16 g/L明胶蛋白胨、 10 g/L酸水解酪蛋白、 10 g/L硫酸钾、 1.4 g/L氯化镁、 0.2 g/L溴化十六烷基三 甲胺、12 g/L琼脂的配方分别称取试剂，加蒸馏水至 1 L，加入10 ml甘油，搅拌均匀，调 pH至7.0，煮 沸至完全溶解。将配制好的 CN培养基121 ℃灭菌15 min，待培养基冷却至 50 ℃～60 ℃后，依次加入终 浓度分别为 0.06 g/L 的青霉素、 15 mg/L的萘啶酮酸和 10 mg/L的游霉素（均为市售无菌抗生素 ，购自酷 来博），配制成 TSA培养基，倾注到灭菌平板上，培养基厚度至少高 5 mm，4 ℃避光保存，保持干燥， 在一个月内使用。 根际土样本制备 随机选择健康的油莎豆植株作为根际土取样目标。采样时使用五点取样法采集样品，即现确定对角 线的中点作为取样点，而后在对角线上选择与中心点距离相等的点进行取样。采样使用的所有工具和收DB15/T 3451 —2024 2 集瓶或袋均需无菌。 用铲子去除地表植被和其他杂质， 使用小锄头轻轻刨开土壤， 松动植株细根处区域， 连根挖出，抖动去掉散土，用修枝剪剪取细根，每棵植株收集 10 g根系样品。将收集的样品进行分装并 做标记，无菌采样袋密封，并立即放入生物样品采集箱中低温保存（采样箱内提前放入冰袋）。低温运 送至实验室。 收集根际土时，在超净工作台内抖落根非根际土，附 着在根部约 1 mm厚的土壤为根际土。将根系样 品放入含 20 ml无菌PBS缓冲液袋无菌离心管中，放置于摇床 120 rpm/min ，室温震荡 20 min。用无菌镊 子剔除根系，剩余悬浮液 4 ℃、6000 g离心20 min收集根际土壤。直接做后续实验或置于 -80 ℃超低温 冰箱保存。 菌株纯化 称取1.5 g根际土壤溶于 25 ml pH 7.0 的PBS缓冲液（磷酸二氢钠和磷酸氢二钠溶液）中，用无菌吸 管吸取25 ml该样品溶液置于盛有 225 ml用无菌生理盐水袋无菌三角瓶中，充分混匀，制成 1:10样品匀 液。用1 ml无菌微量移液器吸取 1:10样品匀液，注于盛有 9 ml无菌生理盐水袋无菌试管中，在振荡器上 振荡混匀，制成 1:100样品匀液，以此类推，制备 1:1000和1:10000样品匀液。选取 1:1000或1:10000样 品匀液，吸取 100 μl样品匀液于含 TSA琼脂培养基的培养皿内，用无菌涂布棒均匀涂布，置于恒温培养 箱30 ℃培养24 h（若菌落太小，可适当延长培养时间）。该菌在 TSA琼脂培养基上应形成白色、微黄色 或偏红褐色、湿润黏稠、表面光滑的菌落。 5 菌株鉴定 属水平的鉴定 5.1.1 革兰氏染色镜检 根据SN/T 4624.1 7中的方法，将 4.3中平板上的菌落做涂片进行革兰氏染色，镜检。 该菌革兰氏染色为阴性，呈红色，杆状。 5.1.2 过氧化氢酶试验 挑取4.3中平板上的疑似菌落至干净的载玻片上，然后滴加 20 μL 3%的过氧化氢溶液，观察是否有 气泡产生，若有气泡产生则为阳性反应，无气泡为阴性反应。该菌会产生气泡，呈阳性反应。 种水平的鉴定 5.2.1 DNA提取 将待测菌株在 TSB培养基（不加琼脂的 TSA琼脂培养基）中 30 ℃培养24 h，将菌液收集于 2 mL灭菌 离心管中， 6000 g离心1 min，弃上清液，菌体沉淀物按细菌基因组 DNA提取试剂 盒操作说明处理，获得 DNA模板溶液。将 DNA溶液加双蒸水稀释 5～10倍，用紫外分光光度计测定 260 nm和280 nm的吸光值，提 取后的DNA模板溶液的 A260/A280 应在1.8～2.0之间。 5.2.2 PCR扩增 利用RNA聚合酶sigama因子（rpoD）基因和 DNA回旋酶B亚基（gyrB）基因特异性引物分别进行 PCR扩 增。特异性引物序列如下： —— rpoD(F:5'TGAAGGCGARATCGAAATCGCCAA3'R:5'YGCMGWCAGCTTYTGCTGGCA3') ； —— gyrB (F: 5'TCBGCRGCVGARGTSATCATGAC3'R:5'TTGTCYTTGGTCTGSGAGCTGAA3') ； DB15/T 3451 —2024 3 —— 反应体系（ 50 μl）：DNA模板4 μl，ddH2O 19 μl ，rpoD-F或gyrB-F 1 μl，rpoD-R或 gryB-R 1μl，2×PCR Mix混合物25 μl。程序： 95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s， 62 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环； 72 ℃延伸5 min，4 ℃冷却。 5.2.3 PCR产物检测 配制1.0%琼脂糖凝胶 30 mL，微波炉加热融化，待冷却至 50 ℃～60 ℃时，加入 1μL核酸染料（ Gold view），倒入制胶板中，凝固 10 min。5 μL 2000 bp Marker 和6 μL PCR产物分别与 6×DNA loading buffer（5:1）混合，分别加入点样孔进行电泳，电压 120 V，电泳30 min。用凝胶成像仪观察，应在 750 bp左右有清晰明亮条带。 5.2.4 测序分析 将目的条带切下，用胶回收试剂盒收集 PCR产物后，送到公司进行测序反应，将两个基因的测序结 果分别在 NCBI网站中进行 Blast比对。 6 结果判定 属水平结果判定 分离的菌株在 TSA琼脂培养基平板上呈现白色、微黄色或偏红褐色，表面光滑的小菌落。 过氧化氢酶试验中会产生气泡，呈阳性反应。 革兰氏染色镜检时应呈红色、杆状、单个散在分布的菌体。 种水平结果判定 两个基因的测序结果分别在 NCBI网站中进行 Blast比对， 从GenBank数据库中参考序列中选择相似性 在97%以上的同源序列 8～10个。使用 MEGA7.0软件将分离株与所选菌株进行 ClustalW 比对，并使用邻接 法（Neighbor -joining） 分别绘制 rpoD和gyrB基因的系统发育树， 根据分支远近确定检测菌株的种水平。 距离最近的（即在同一个分支的）的假单胞菌的种名即为待鉴定假单胞菌的种名。两种基因的鉴定结果 应一致。