ICS 65.020.30 CCS B 41 15 内蒙古自治区 地方 标准 DB15/T 3442—2024 羊链球菌病 诊断技术 Diagnostic techniques for sheep streptococcosis 2024-05-31发布 2024-07-01实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 3442 —2024 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（ SAM/TC 19）归口。 本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古金草原生态科技集团有限公司、内蒙古盛健 生物科技有限责任公司、内蒙古杜美牧业生物科技有限公司、巴彦淖尔市青青草原牧业有限公司。 本文件主要起草人：王娜、戴伶俐、张月梅、白帆、杨斌、宋越、张帆、李慧、达来宝力格、刘威、 钱琳娜、赵世华、张英、 刘敏、赵俊利、菅瑞珍、董少华、 刘学文、王建光、杨文圃、马海鹏。 DB15/T 3442 —2024 1 羊链球菌病诊断技术 1 范围 本文件规定了绵羊链球菌病的诊断技术。 本文件适用于绵羊链球菌病的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 4789.28 食品安全国家标准 食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 羊链球菌 streptococcus sheep 属于链球菌科，链球菌属，马链球菌兽疫亚种，革兰氏染色阳性，多呈双球排列，很少单个存在 ， 无运动性，不形成芽孢，需氧或兼性厌氧菌。 羊链球菌病 sheep streptococcosis 由C群马链球菌兽疫亚种引起的一种急性、热性、败血性传染病，也称羊败血性链球菌病。临床以 咽喉部及下颌淋巴结肿胀、大叶性肺炎、呼吸异常困难、出血性败血症，胆囊肿大为特征。 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction 一种级联反复循环的 DNA合成反应过程。一般由三个步骤组成：模板 DNA的热变性，特异性引物与模 板DNA的结合及引物延伸新 DNA链的合成。 4 流行病学 易感动物 任何品种、性别及日龄的羊只均易感，其中绵羊比山羊易感，幼龄羊、母羊的感染率较高。 DB15/T 3442 —2024 2 传染源 患病羊和带菌羊是主要传染源。 传播途径 该病主要通过消化道、呼吸道感染，也可通过吸血昆虫、皮肤、黏膜伤口感染健康羊。 发病季节 一年四季均可发病，寒冷的冬季及早春季多发，初次发病呈地方性流行，老疫区呈散发。 5 诊断技术 临床诊断 5.1.1 临床症状 5.1.1.1 最急性型症状 羊只突然发病，无明显临床症状， 24 h内死亡。 5.1.1.2 急性型症状 病羊体温升高到 41 ℃，精神沉郁、食欲废绝、反刍停止、流涎、呼吸困难，鼻孔流浆液性、脓性 分泌物。眼结膜充血，流出脓性分泌物。有些病例可见眼睑、面颊以及乳房等部位肿胀。咽喉肿胀，颌 下淋巴结肿大。粪便带有黏液血液，最后衰竭倒地，多窒息死亡。病程 1 d～3 d。 5.1.1.3 亚急性型症状 体温升高、食欲减退，呼吸困难、咳嗽，鼻流黏性透明鼻液， 病程7 d～14 d。 5.1.1.4 慢性型症状 一般轻度微发热，消瘦，食欲减退，步态僵硬。有些病羊出现关节炎。病程 1个月左右。 5.1.2 病理变化 5.1.2.1 败血型 主要发生于成年羊。病羊全身多个组织器官发生败血型变化；淋巴结肿大、出血；鼻腔、咽喉、气 管等上呼吸道黏膜水肿；肝脏、胆囊、脾脏、肾脏肿大、出血、质地变软；胃肠黏膜肿胀、充血、出血、 脱落；胸膜腔、腹腔、心包腔积液；各脏器浆膜面常覆有黏稠、丝状的纤维素样物质。 5.1.2.2 肺炎型 主要发生于羔羊。 发病初期表现为支气管肺炎， 肺脏炎性充血、 水肿； 发病中期， 呈纤维素性肺炎； 发病后期，肺脏坏死，液化形成空洞或者脓腔。 实验室诊断 5.2.1 试剂和材料 DB15/T 3442 —2024 3 生理盐水、细菌微量生化反应管及指示剂、 Tap酶、TAE电泳缓冲液、 DNA Marker 等。除另有规定， 所用试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682 的蒸馏水。 各种培养基的制备方法见附录 A中表A.1。 5.2.2 仪器和设备 匀质器和匀质杯、天平、培养箱、恒温水浴锅、核酸电泳仪、 PCR仪、高压蒸汽灭菌锅、凝胶成像 系统、光学显微镜、恒温摇床。 5.2.3 样品采集 5.2.3.1 鼻拭子的采集 对活羊采取鼻腔拭子。采样人员将棉拭子轻轻插入鼻腔 ,与鼻中隔平行方向插入约 2 cm～5 cm，轻 旋转棉拭子 旋转2～3圈，当羊出现喷嚏反射后，轻轻抽出棉拭子。在 2 ℃～8 ℃下24 h内完成送检工 作。如样品不能及时送到实验室，应置于 -20 ℃以下保存。 5.2.3.2 组织样品的采集 对病死羊主要采集其气管和肺脏等组织，置于无菌密封袋或采样杯；在 2 ℃～8 ℃下24 h内完成 送检工作。如样品不能及时送到实验室，应置于 -20 ℃以下保存。 5.2.4 病原检测 5.2.4.1 涂片镜检 无菌取气管、肺等组织进行涂片，按照 GB/T 4789.28 所述的方法进行革兰氏染色。 马链球菌兽疫亚 种为革兰氏阳性球菌，多数呈链排列。 5.2.4.2 细菌的分离 5.2.4.2.1 鼻腔拭子的分离 将鼻腔拭子样品置于 5 mL 5%马血清的胰蛋白胨大豆肉汤中， 37 ℃培养16 h～20 h后，划线接种 于含5%马血清的胰蛋白胨大豆琼脂平板 (TSA)或普通琼脂绵羊血平板。 5.2.4.2.2 组织样品的分离 用经火焰灭菌并冷却的接种环蘸取病料内部组织后划线接种于含 5%马血清的胰蛋白胨大豆琼脂平 板(TSA)或普通琼脂绵羊血平板（按照 附录A中表A.1执行），于37 ℃培养16 h～20 h后观察。 5.2.5 初步鉴定 羊链球菌在 37 ℃培养16 h后， 在普通琼脂绵羊血平板和含 5%马血清的胰蛋白胨大豆琼脂平板 (TSA) 上形成圆形微凸起 、表面光滑、边缘整齐、灰白色的菌落 ，直径约 0.5 mm～1.0 mm，菌株β溶血。该 菌为革兰氏阳性球菌，无芽胞，有荚膜。 菌落生长特征、革兰氏染色、菌体形态符合者，可初步确定为羊链球菌。 5.2.6 生化鉴定 挑取纯培养物的单菌落接种至细菌微量生化反应管，置于 37 ℃培养箱中， 24 h后观察结果。 马链 球菌兽疫亚种发酵葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇；不能发酵 菊糖、甘露醇； 靛基质试验、 V-PDB15/T 3442 —2024 4 试验呈阴性。 5.2.7 羊链球菌 PCR检测 5.2.7.1 DNA提取 培养产物取 1 mL于4 ℃，12000 rpm 离心1 min，弃上清，沉淀用细菌基因组 DNA提取试剂盒提取基 因组DNA。 5.2.7.2 PCR反应体系 总体积25 μL，其中2×Taq Mix 12.5 μL，上下游引物 (10 μmol/L) 各1 Μl（见附录 B中表 B.1），羊多杀性巴氏杆菌 DNA模板1.0 μL，去离子水 9.5 μL。 5.2.7.3 PCR反应条件 94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s ，30个循环； 72 ℃延伸7 min。若不 立即电泳将 PCR产物置于 -20℃保存。 5.2.7.4 PCR反应产物检测 将PCR反应产物于 1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，电压为 120 V，时间30 min。 5.2.7.5 电泳结果 16S rRNA PCR 产物凝胶电泳成像结果显示扩增条带在 1500 bp处，无杂带，且阴性对照未出现特异 性条带，可将 PCR产物测序，测序结果与标准序列进行比对。 6 结果判定 符合5.1，可判定为绵羊链球菌病疑似病例。 符合5.1、5.2.5、5.2.6、5.2.7，可判定为绵羊链球菌病确诊。 7 废弃物处理和防止污染的措施 依据《病死及病害动物无害化处理技术规范》及《病原微生物实验室生物安全管理条例》对废弃物 进行无害化处理。