ICS 65.020.30 CCS B 41 15 内蒙古自治区 地方 标准 DB15/T 3441—2024 羊多杀性巴 氏杆菌病诊断技术 Diagnostic techniques for pasteurella multocida in sheep 2024-05-31发布 2024-07-01实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 3441 —2024 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（ SAM/TC 19 ）归口。 本文件主要起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古杜美牧业生物科技有限公司。 本文件主要起草人：王娜、戴伶俐、白帆、张月梅、杨斌、宋越、张帆、李慧、达来宝力格、刘威、 钱琳娜、赵世华、刘学文、刘敏、张英 赵俊利、菅瑞珍、董少华。 DB15/T 3441 —2024 1 羊多杀性巴氏杆菌病诊断技术 1 范围 本文件规定了羊多杀性巴氏杆菌病的诊断技术。 本文件适用于羊多杀性巴氏杆菌病的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 4789.28 食品安全国家标准 食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 多杀性巴氏杆菌 pasteurella multocida 属于巴氏杆菌科，巴氏杆菌属，革兰氏阴性球杆菌或短杆状菌，两端钝圆，无鞭毛， 无芽孢，有 荚膜。根据荚膜抗原可分为 A、B、D、E、F 5 种血清型，５种荚膜血清型的基因分别为 hyaD- hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ、fcbD。 羊多杀性巴氏杆菌病 pasteurella multocida in sheep 由多杀性巴氏杆菌引起的一种以败血和肺炎为主要特征的细菌性传染病。 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction 一种级联反复循环的 DNA合成反应过程。一般由三个步骤组成：模板 DNA的热变性，特异性引物 与模板DNA的结合及引物延长新 DNA链的合成。 4 流行病学 易感动物 绵羊山羊均可发病，绵羊比山羊易感，羔羊、幼龄羊比成年羊易感。山羊散发，绵羊群发。 DB15/T 3441 —2024 2 传染源 患病羊和带菌羊是主要传染源。 传播途径 该病主要通过消化道、呼吸道感染，也可通过吸血昆虫、皮肤、黏膜、伤口感染健康羊。健康带菌 羊在受寒、长途运输、饲养管理不当等情况导致抵抗力降低时，可发生内源性感染，出现临床症状。 发病季节 一年四季均可发病，气候寒冷、闷热潮湿的季节多发，呈散发或地方性流行。 5 诊断 临床诊断 5.1.1 临床症状及病理变化 5.1.1.1 最急性型症状 羊突然发病，呈高热、呼吸困难、抽搐等症状，数分钟或数小时内死亡，难以看到特征性病变。 5.1.1.2 急性型症状 病羊精神沉郁，食欲废绝，体温升高至 41 ℃～42 ℃。呼吸急促、咳嗽、鼻孔出血；眼结膜潮红， 有黏性分泌物；初期便秘，后期腹泻，有时粪便为血水，颈部、胸下部位发生水肿；病羊常在严重腹泻 后虚脱而死；病程 2 d～5 d。 解剖可见下颌淋巴结水肿、出血，气管内有泡沫淡红色液体，心包膜上存在纤维素絮片且含有包积 液，胸腔内含有大量浆液性纤维素性渗出液，肺脏发生淤血、出血，间质变宽，切面有大量的浆液，组 织中存在不同大小的坏死 灶，肺门淋巴结发生肿胀、出血。 5.1.1.3 慢性型症状 病羊消瘦，食欲减退，流黏脓性鼻液；咳嗽；呼吸困难；颈胸部有时发生水肿；病羊腹泻，粪便恶 臭，机体虚弱，体温下降，四肢厥冷。 解剖可见皮下有液体浸润和小出血点；胸腔内有黄色渗出物，肺淤血，存在小出血及肝变区，偶见 黄豆至胡桃大的化脓灶；胃肠道有出血性炎症；其他器官水肿和淤血。病期较长者皮下胶样浸润，常有 纤维素性胸膜肺炎，肝有坏死灶。 实验室诊断 5.2.1 试剂和材料 生理盐水、细菌微量生化反应管及指示剂、 Tap酶、TAE电泳缓冲液、 DNA Marker 等。 除另有规定，所用试剂均 为分析纯，水为符合 GB/T 6682 的蒸馏水。 各种培养基的制备方法按照附录 A要求。 5.2.2 仪器和设备 DB15/T 3441 —2024 3 匀质器和匀质杯、天平、培养箱、恒温水浴锅、核酸电泳 仪、PCR仪、高压蒸汽灭菌锅、凝胶成像 系统、光学显微镜、恒温摇床。 5.2.3 样品采集 5.2.3.1 鼻拭子的采集 对活羊采取鼻腔拭子。采样人员将棉拭子轻轻插入鼻腔，与鼻中隔平行方向插入约 2 cm～5 cm，轻 旋转棉拭子旋转 2～3圈，当羊出现喷嚏反射后，轻轻抽出棉拭子。在 2 ℃～8 ℃下24 h内完成送检工 作。如样品不能及时送到实验室，应置于 -20 ℃以下保存。 5.2.3.2 组织样品的采集 对病死羊主要采集其气管和肺脏等组织，置于无菌密封袋或采样杯；在 2 ℃～8 ℃下24 h内完成 送检工作。如样品不能及时送到实验室，应置于 -20 ℃以下保存。 5.2.4 病原检测 5.2.4.1 涂片镜检 无菌取气管、肺等组织进行涂片，按照 GB/T 4789.28 所述的方法进行革兰氏染色。多杀性巴氏杆菌 为革兰氏阴性菌，菌体呈球杆状或短杆状，两端钝圆。瑞士染色或美蓝染色呈典型的两极着色。 5.2.4.2 细菌的分离 5.2.4.2.1 鼻腔拭子的分离 将鼻腔拭子样品置于 5 mL 5%马血清的胰蛋白胨大豆肉汤中， 37 ℃培养16 h～20 h后，划线接种 于含5%马血清的胰蛋白胨大豆琼脂平板或普通琼脂绵羊血平板。 5.2.4.2.2 组织样品的分离 用经火焰灭菌并冷却的接种环蘸取 病料内部组织后 划线接种于含 5%马血清的胰蛋白胨大豆琼脂平 板或普通琼脂绵羊血平板 ,按照附录 A的要求，于 37 ℃培养16 h～20 h后观察。 5.2.5 初步鉴定 羊多杀性巴氏杆菌 37 ℃培养16 h后，在普通琼脂绵羊血平板和含 5%马血清的胰蛋白胨大豆琼脂平 板(TSA)上形成圆形微凸起 、表面光滑、边缘整齐、半透明的菌落，直径约 0.3 mm～1.2 mm，菌株γ溶 血。该菌为革兰氏阴性杆菌，无芽胞，有荚膜。 菌落生长特征、革兰氏染色、菌体形态符合者，可初步确定为羊多杀性巴氏杆菌。 5.2.6 生化鉴定 挑取纯培养物的单菌落 接种至细菌微量生化反应管，置于 37 ℃恒温培养箱中， 24 h后观察结果。 羊多杀性巴氏杆菌发酵 木糖、海藻糖、甘露醇、葡萄糖，鸟氨酸脱羧酶、吲哚试验为阳性，脲酶、乳酶、 甲基红、氧化酶、 VP试验为阴性 。 5.2.7 羊多杀性巴氏杆菌 PCR检测 5.2.7.1 DNA提取 DB15/T 3441 —2024 4 培养产物取 1 mL于4 ℃，12000 rpm 离心1 min，弃上清，沉淀用细菌基因组 DNA提取试剂盒提取基 因组DNA。 5.2.7.2 引物序列 引物序列见附录 B。 5.2.7.3 PCR反应体系 总体积25 μL，其中2×Taq Mix 12.5 μL，上下游引物 (10 μmol/L) 各1 μL，羊多杀性巴氏 杆菌DNA模板1.0 μL，去离子水 9.5 μL。 5.2.7.4 PCR反应条件 94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，30个循环； 72 ℃延伸7 min。若不 立即电泳将 PCR产物置于 -20 ℃保存。 5.2.7.5 PCR反应产物检测 将PCR反应产物于 1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，电压为 120 V，时间30 min。 5.2.7.6 电泳结果 16S rRNA PCR 产物凝胶电泳成像结果显示扩增条带在 1500 bp 处，无杂带，且阴性对照未出现特 异性条带，可将 PCR产物测序，测序结果与标准序列进行比对。 KMT1基因扩增产物为 PCR产物460 bp，对KMT1基因PCR阳性的样品用上述方法进行 5个荚膜型 鉴定。 6 结果判定 符合5.1，判定为羊多杀性巴 氏杆菌疑似病例。 符合5.1、5.2.5、5.2.6、5.2.7，判定为羊多杀性巴氏杆菌确诊病例。 7 废弃物处理和防止污染的措施 依据《病死及病害动物无害化处理技术规范》及《病原微生物实验室生物安全管理条例》对废弃物 进行无害化处理。