ICS 65.020.30 CCS B 41 15 内蒙古自治区 地方 标准 DB15/T 3439—2024 规模化羊场 绵羊支原体肺炎诊断及免疫 技术规程 Technical protocols for diagnosis and immunization of mycoplasma ovipneumoniae on large scale sheep farms 2024-05-31发布 2024-07-01实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 3439 —2024 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（ SAM/TC 19 ）归口。 本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院，五原县动物 疫病预防控制中心，内蒙古盛健生物科 技有限责任公司，内蒙古金草原生态科技集团有限公司，内蒙古杜美牧业生物科技有限公司。 本文件主要起草人：戴伶俐、白帆、王娜、宋越、张帆、张月梅、赵世华、刘威、杨斌、钱琳娜、 达来宝力格、凤英、郭天龙、李慧、张英、王强胜、杨文圃、王建光、刘学文。 DB15/T 3439 —2024 1 规模化羊场绵羊支原体肺炎诊断及免疫技术规程 1 范围 本文件规定了规模化羊场绵羊支原体肺炎诊断及免疫技术。 本文件适用于规模化羊场绵羊肺炎支原体感染的临床诊断、实验室检测和免疫。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 GB/T 18635 动物防疫 基本术语 NY/T 2835 奶山羊饲养管理技术规范 NY/T 3052 舍饲肉羊饲养管理技术规范 3 术语和定义 GB/T 18635 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 绵羊肺炎支原体 mycoplasma ovipn eumoniae （Mo） 属于柔膜纲（ Mollicutes ）支原体科（ Mycoplasmataceae ）支原体属（ Mycoplasma ）成员。 Mo直径 约125 nm～500 nm，无细胞壁。 Mo合成能力差，需要在培养基中加入酵母浸出液和 20%的马血清进行培 养。在固体培养基上形成针尖大小的透明菌落，肉眼不易观察，低倍镜下观察菌落呈“桑葚状”，中心 无脐，边缘不整齐。 Mo在55 ℃条件下5 min～15 min即可被彻底灭活，对常用的盐类、来苏水、石碳酸 等消毒剂敏感，对大部分大环内酯类和四环素类抗生素敏感。 Mo由于没有细胞壁，对青霉素、醋酸铊有 抵抗力。 规模化羊场 large-scale sheep farm 存栏羊300只以上的羊场。 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction （PCR） 一种级联反复循环的 DNA合成反应过程。一般由三个步骤组成：模板的热变性，寡核苷酸引物复性 到单链靶序列上以及由热稳定 DNA聚合酶催化的复性引物引导的新生 DNA链延伸聚合反应。 DB15/T 3439 —2024 2 间接酶联免疫吸附试验 indirect enzyme -linked immunosorbentassay （间接ELISA） 已知的抗原吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板，也称酶标板 ) 表面，样品中待检测抗体于抗 原结合形成复合物，再用酶标二抗与复合物中的抗体结合，最后加入底物，用分光光度计测定加底物后 的显色程度，确定待测抗体的方法。 4 临床诊断 流行特点 绵羊肺炎支原体主要侵害绵羊和山羊， 各日龄羊均可发病， 以 3月龄以下的羔羊为主， 身体状况差， 机体抵抗力下降的羊更易感染。绵羊肺炎支原体在自然条件下可以通过空气 -飞沫（气溶胶）传染，引 发传染性胸膜肺炎。病畜通过咳嗽、打喷嚏、 唾沫等向外界传播病原。 Mo引起的肺炎常呈地方流行性， 一年四季都发，其中夏末和冬季频发。环境因素也会导致本病流行，阴雨连绵、寒冷潮湿、羊群密集、 拥挤等因素容易引起传染的发生。发病率因地域和养殖模式而有所不同。 临床症状 绵羊肺炎支原体感染的羊临床上主要表现为发热、咳嗽、流涕、消瘦、贫血、生长发育迟缓、食欲 减退等症状。有的病羊有腹胀、腹泻、口腔溃疡、腰背拱起等症状出现。 病理变化 典型病变主要集中于肺脏中，病程缓急、严重程度不同呈现出虾肉样、大理石样、肝变样。严重时 肺脏与胸腔粘连，出现胸腔积液。尖叶病变严重，心叶和膈叶次之，其他器官的病变不明显。 5 实验室诊断 样品采集 5.1.1 鼻拭子样本采集 鼻拭子采集后置装有 0.5 mL～1.0 mL 灭菌生理盐水的无菌离心管中， 盖严， 冷藏条件下快速送检。 5.1.2 气管分泌物样本采集 气管分泌物可直接收集，冷藏条件下快速送检。 5.1.3 血清样本采集 颈静脉无菌采血 3 mL～5 mL，室温放置 1 h后4 ℃放置过夜，室温 3000 rpm 离心5 min～10 min， 分离血清，于 -20 ℃保存。 所有样本均应妥善包装，防渗漏，防破碎。标签用记号笔填写，应信息完整，字迹清晰，并附采样 单。 5.1.4 肺组织样本采集 DB15/T 3439 —2024 3 无菌条件下取样，在肺组织病变与正常组织交界处，取 3 cm3～5 cm3大小的组织样本，冷藏条件下 快速送检或置无菌 40%～50%甘油生理盐水中，冷藏条件下快速送检。 病原的分离鉴定 5.2.1 仪器 电子天平，光学显微镜，恒温摇床，生物安全柜等。 5.2.2 耗材 微量可调移液器及配套吸头， 10 mL无菌离心管，涂布棒， 0.45 μm滤器，一次性培养皿，一次性 培养瓶。 5.2.3 试剂与配制 支原体液体培养基，支原体固体培养基，马血清， 1%醋酸铊， 8万单位青霉素。 培养基及试剂配制参见附录 A。 5.2.4 肺组织样本处理 在表层消毒后，在病变和正常组织交界处取米粒至绿豆大小深层肺组织置于玻璃匀浆器中，加入 3 mL～4 mL灭菌PBS，反复挤压组织块，制成组织悬液。将组织悬液自然沉淀 10 min，取上部液体通过 0.22 μm孔径的滤膜过滤后，将滤液作为待检样本。 5.2.5 病原菌分离培养 滤液加入 10 mL支原体液体培养基中（含醋酸铊和青霉素）， 37 ℃，150 rpm 培养48 h～72 h，液 体变为橙红色，取 1 mL培养产物转入 10 mL培养基中，传代培养，盲传三代后，取 3 mL培养液提取基因 组DNA用于PCR检测。 5.2.6 病原形态观察 培养物涂布于含醋酸铊和青霉素的支原体固体培养基中，置于 37 ℃ 培养3 d～7 d，待培养板表面 生长出肉眼可见的半透明菌落，用显微镜观察菌落形态，边缘不整齐，呈现“桑葚状”菌落，无脐。 （见 附录C.1） 5.2.7 染色镜检 取培养物作涂片， 用瑞士染色，镜检可见具有多形性、 小球状、 杆状等，两极着色，许多聚集成团， 直径约为 0.2 μm（见附录 C.2）。 5.2.8 病原生化鉴定 5.2.8.1 生化管 葡萄糖、甘露醇、精氨酸、尿 素、磷酸酶等生化管为商品化试剂。 5.2.8.2 对照菌株 绵羊肺炎支原体 Y98标准株。 5.2.8.3 操作方法： DB15/T 3439 —2024 4 吸取10 μL绵羊肺炎支原体液体纯培养物，分别深部接种于各种生化管中，置于 37 ℃恒温培养箱 中，12 h～24 h后观察结果。绵羊肺炎支原体分解葡萄糖、不分解甘露醇、精氨酸和尿素，无磷酸酶活 性，绵羊肺炎支原体生化反应鉴别见附录 C。 5.2.9 病原分离判定 液体培养基培养产物使培养基变橙红，菌液呈现薄云雾状，不明显浑浊，菌体在培养液中呈现流沙 状。菌落特征明显，符合生化反应，初步判定为绵羊肺炎支原体分离阳性，否则判定为未检出绵羊肺炎 支原体。 PCR检测 5.3.1 仪器和耗材 PCR仪，电炉，离心机，混匀器，微量可调移液器， 1.5 mL 离心管， PCR反应管，核酸电泳仪，凝 胶成像系统。 5.3.2 试剂 灭菌双蒸水， TaqMix，琼脂糖，细菌基因组 DNA提取试剂盒。 5.3.3 样品处理 5.3.3.1 拭子样品 鼻拭子样本于采集管中涡旋 5 min，取400 μL悬液，4 ℃，12000 rpm 离心20 min，弃上清，沉淀 用细菌基因组 DNA提取试剂盒提取基因组 DNA。 5.3.3.2 气管分泌物样品 气管分泌物样品于采集管中涡旋 5 min，取400 μL悬液，4 ℃，12000 rpm 离心20 min，弃上清， 沉淀用细菌基因组 DNA提取试剂盒提取基因组 DNA。 5.3.3.3 菌液样品 培养产物取 3 mL于4 ℃，12000 rpm 离心20 min，弃上清，沉淀用细菌基因组 DNA提取试剂盒提取基 因组DNA。 5.3.4 引物序列 见附录D。 5.3.5 PCR反应体系