ICS 65.020.30 CCS B 40 15 内蒙古自治区 地方 标准 DB15/T 3401—2024 奶绵羊胚胎冷冻解冻技术 规程 Code of practice for freezing and thawing of dairy sheep embryo 2024-04-15发布 2024-05-15实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 3401 —2024 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件归口单位：内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（ SAM/TC 19 ）归口。 本文件起草单位：内蒙古大学、内蒙古乌兰察布市畜牧工作站、蒙天然牧业科技发展有限公司、内 蒙古丰东知盈牧业科技有限公司。 本文件主要起草人：苏小虎、张立、李光鹏、郑重、张立果、苏广华、杨磊、白春玲、赵跃芳、宋 丽爽、张功、刘信、刘建宁、刘权、张惠文、萨仁格勒。 DB15/T 3401 —2024 1 奶绵羊胚胎冷冻解冻技术 规程 1 范围 本文件规定了奶绵羊体内胚胎形态鉴定与程序化冷冻及解冻技术要点。 本文件适用于奶绵羊的体内胚胎程序化冷冻保存及解冻。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 NY/T 1571 羊胚胎移植技术规程 NY/T 1674 牛羊胚胎质量检测技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 奶绵羊 dairy sheep 以产奶为主要生产方向的绵羊品种。 胚胎冷冻 embryo freezing 将胚胎和冷冻液装入冷冻管中，经过一定的降温方式将胚胎保存于液氮中，使其代谢和发育处于暂 时停滞状态，解冻后仍能正常发育的一种保存方法。 植冰 seeding 又称诱发结晶，是指在略低于溶液冰点的温度下通过加入冰母或强行冷却的方式诱导溶液结冰。 胚胎解冻 embryo thawing 将处于冷冻状态的胚胎进行解冻处理，以恢复胚胎发育能力的过程。 4 胚胎形态鉴定 DB15/T 3401 —2024 2 供体羊发情后的 5.5 d～ 6.5 d体内生产的胚胎按照 NY/T 1571 使用体式显微镜进行形态学鉴定， 形态示意图见附录 A。 5 胚胎冷冻保存 胚胎冷冻所需器材 体视显微镜、程序化冷冻仪、液氮罐、捡胚管、 0.25 mL冷冻细管、装管器、玻璃细管、 0.22 μm 细菌滤器、胚胎培养皿、记号笔、低温标签纸。 胚胎冷冻所需溶液 保存液：含 0.4%（w/v）牛血清白蛋白的 PBS液。 冷冻液Ⅰ：含1.5 mol/L 乙二醇的保存液。 冷冻液Ⅱ： 含10%（v/v）甘油的保存液。 冷冻液Ⅲ：含 6%（v/v）甘油的保存液。 冷冻液Ⅳ：含3%（v/v）甘油的保存液。 胚胎操作室要求 温度在20 ℃～25 ℃之间，操作前使用紫外灯消毒 20 min～30 min，胚胎操作区域用 75%酒精擦拭 消毒。 胚胎选择 根据形态选择发育期为早期桑椹胚（ EM）、紧缩桑椹胚（ CM）、早期囊胚（ EB）、囊胚（ BL）和扩 张囊胚期（ EXB）的A（1）、B（2）级胚胎（附录 A图A.2、A.3）进行冷冻。 胚胎的洗涤与平衡 5.5.1 方法一 乙二醇冷冻液冷冻胚胎的洗涤与平衡 胚胎冷冻前用保存液洗涤 5次～6次；洗涤后的胚胎放入冷冻液 Ⅰ中，室温下平衡 15 min～20 min。 5.5.2 方法二 甘油冷冻液一步法胚胎冷冻的洗涤与平衡 胚胎冷冻前用保存液洗涤 5次～6次；洗涤后的胚胎放入冷冻液 Ⅱ中，室温下平衡 15 min～20 min。 5.5.3 方法三 甘油冷冻液三步法胚胎冷冻的洗涤与平衡 胚胎冷冻前用保存液洗涤 5次～6次；洗涤后的胚胎依次放入冷冻液 Ⅳ、Ⅲ和Ⅱ中，每种冷冻液中室 温下平衡 4 min～5 min。 胚胎装管 装管方法见附录 B，每支装 1枚～10枚相同发育期、相同级别胚胎。 胚胎记录 在标签纸上打印记录胚胎信息，包括胚胎的母本品种、母本耳号、父本品种、父本耳号、数量、发 育期、质量以及冷冻日期，粘贴于细管上。数量、发育期、质量标注方式为 X EM/CM/EB/BL/EXB 1/2，其中DB15/T 3401 —2024 3 X表示数量， EM/CM/EB/BL/EXB 表示发育期，下标 1/2表示A/B级胚胎级别。如 2 CM 1代表2枚A级紧缩桑椹 胚，2 CM 2代表2枚B级紧缩桑椹胚。 冷冻程序 5.8.1 方法一 乙二醇冷冻液冷冻胚胎程序 胚胎冷冻细管由室温直接置入 -6.0 ℃的程序化冷冻仪中，平衡 4 min～5 min后，在-6.0 ℃时植 冰1 s～3 s，继续平衡 5 min，然后以 - 0.3～- 0.5 ℃/min的速率降温至 -35 ℃，平衡 10 min，取出胚 胎冷冻细管，迅速投入液氮罐中保存。同时详细记录胚胎信息，胚胎冷冻信息登记表见附录 C表C.1。 5.8.2 方法二 甘油冷冻液冷冻胚胎程序 胚胎冷冻细管由室温直接置入 -6.5 ℃的程序化冷冻仪中，平衡 4 min～5 min后，在-6.5 ℃时植 冰1 s～3 s，植冰之后的操作步骤同 5.8.1。 6 胚胎解冻 胚胎解冻所需器材 水浴锅、其 余同5.1（体视显微镜、液氮罐、捡胚管、 0.22 μm细菌滤器、胚胎培养皿）。 胚胎解冻所需溶液 保存液配方同 5.2。 解冻液Ⅰ：含0.25 mol/L蔗糖的保存液。 解冻液Ⅱ：含1 mol/L蔗糖的保存液。 解冻液Ⅲ：含0.3 mol/L蔗糖+3%（v/v）甘油的保存液。 解冻液Ⅳ：含0.3 mol/L蔗糖+6%（v/v）甘油的保存液。 胚胎操作室要求 胚胎操作室要求同 5.3。 解冻程序 6.4.1 方法一 一步法解冻程序 解冻时，从液氮罐中取出细管在空气中停留 10 s～15 s后，浸入 28 ℃～32 ℃水浴中 20 s，然后将 胚胎冷冻细管用灭菌吸水纸擦干，用 75%酒精棉球擦拭细管，晾干 15 s～20 s，剪去封口端，把胚胎推 出，乙二醇冷冻液冷冻胚胎置入解冻液 Ⅰ中、甘油冷冻液冷冻胚胎置入解冻液 Ⅱ中平衡4 min～5 min， 然后在保存液中洗 5次～6次，镜检备用。同时在记录本上详细记录胚胎信息，解冻胚胎信息登记表见附 录C表C.2。 6.4.2 方法二 三步法解冻程序 解冻时，从液氮罐中取出细管在空气中停留 10 s～15 s后，浸入 25 ℃～32 ℃水浴中 20 s，然后将 胚胎冷冻细管用灭 菌吸水纸擦干，用 75%酒精棉球擦拭细管，晾干 15 s～20 s，剪去封口端，把胚胎推 出后，依次置入解冻液 Ⅳ、Ⅲ和Ⅱ中平衡4 min～5 min，然后在保存液中洗 5次～6次，镜检备用。同时 在记录本上详细记录胚胎信息，解冻胚胎信息登记表按照附录 C中的表C.2。 DB15/T 3401 —2024 4 解冻后胚胎形态鉴定 按NY/T 1674 执行。解冻后胚胎形态等级信息登记表见附录 C表C.2。