ICS 65.020.20 CCS B 16 15 内蒙古自治区 地方 标准 DB15/T 3380—2024 马铃薯镰刀 属真菌病害检测技术规程 Technical code for detection of Fusarium fungi disease in potato 2024-03-15发布 2024-04-15实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 3380 —2024 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。 本文件由内蒙古自治区马铃薯标准化技术委员会（ SAM/TC 40 ）归口。 本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古农业大学，乌兰察布市农林科学研究所、内 蒙古自治区农牧业技术推广中心、喀喇沁旗农牧局、武川县农牧技术推广中心。 本文件主要起草人：赵远征、徐利敏、王东、周洪友、邱廷艳、张晓明、王真、王玉凤、贾瑞芳、 谢锐、邱鑫泽、牟英男、陈文晋、肖皓文、张宇。 DB15/T 3380 —2024 1 马铃薯镰刀属真菌病害检测技术规程 1 范围 本文件规定了马铃薯镰刀属真菌病害检测的原理、仪器设备和用具、形态检验、致病性测定、 PCR 检验、样品复检等技术要求和方法。 本文件适用于马铃薯镰刀属真菌病害的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 SN/T 2729 马铃薯炭疽病菌检疫鉴定方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 镰刀属真菌 (Fusarium spp.)是一种重要的植物病原菌，属无性真菌类，有性时期为子囊菌门。镰 刀属真菌主要危害马铃薯植株和块茎。本标准以病原菌在植株和块茎上的危害症状，菌落、孢子等形态 学特征，回接致病性测定及 PCR反应结果为鉴定依据，将上述各项措施综合形成一套检测技术体系。 5 仪器设备和用具 仪器设备 超净工作台、显微镜、高压灭菌锅、光照培养箱、 PCR仪、离心机、凝胶电泳仪、漩涡震荡仪、水 浴锅、凝胶成像系统、分析天平。 检测工具 接种针、手术刀、镊子、挑针、载玻片、盖玻片、滴管、离心管、培养皿、三角瓶、酒精灯。 6 形态检验 调查取样 选取田间萎蔫、干枯发病植株，观察根部腐烂情况，检查是否褐变或出现白色菌丝体；剖开根茎处 维管束观察是否出现黄化或褐变；田间或窖藏观察马铃薯块茎病变情况，在块茎脐部下方 2 cm左右处横DB15/T 3380 —2024 2 切，或切取表皮凹陷病斑处进行观察，观察是否出现维管束褐变，块茎中空或腐烂并伴随白色菌丝层。 将具有典型特征的病株、病薯取样。 病原菌分离培养和纯化 将病样表面清洗晾干，选择病斑附近的病健交界处，切取 0.3 cm×0.3 cm×0.1 cm大小的薄片， 75% 酒精消毒 30 s，用无菌滤纸吸干，在 0.1%次氯酸钠浸泡 2 min，再用无菌水冲洗 3次。待组织干燥后置于 PDA培养基上，在 25 ℃恒温下光照、黑暗交替各 12 h培养5 d。待组织长出菌丝后，挑取菌丝体转移到 新的PDA培养基上进行培养。待菌落长至培养皿 2/3时，采用平板稀释法进行单孢分离，并获得纯培养。 病原菌形态学鉴定 将PDA培养基上培养 7 d的菌落拍照并观察其形态， 典型菌落气生菌丝多呈絮状或毡状， 白色、 紫色、 淡粉色或黄白色。利用挑针挑取少量菌组织，载玻片上以水浮载制成玻片，显微镜下观察孢子形态，小 型分生孢子呈卵圆形或椭圆形，单孢，大小 2 µm～4 µm×4 µm～8 µm；大型分生孢子略弯曲，镰刀形或 月牙形， 2～5个分隔，多为 3个分隔，大小 3 µm～8 µm×11 µm～70 µm；厚垣孢子球形，表面不光滑， 单生或串生。 7 致病性测定 将纯培养物配制成孢子悬浮液，伤口接种法进行马铃薯植株和薯块回接，接种 28 d后观察马铃薯的 发病情况。如出现与病样一致的症状则判定病原菌能够引起该病害发生。 8 PCR检验 DNA提取 按照SN/T 2729 ，采用CTAB法提取菌株基因组 DNA。 对照设置 以马铃薯枯萎病病原菌 DNA作为阳性对照，以不添加 DNA模板反应体系作为阴性对照。 PCR 扩增 以菌株DNA为模板，利用镰刀菌属真菌的特异性引物 EF-1H：（5ʹ-ATGGGTAAGGAAGACAAGAC -3ʹ），EF- 2T：（5ʹ-GGAAGTACCAGTGATCATGTT -3ʹ）进行PCR扩增。PCR反应体系总体积为 25 μL，其中模板 DNA 1 μ L，上下游引物各 1 μL，2×Easy Taq PCR Super Mix 12.5 μL, ddH 2O 9.5 μL。PCR扩增程序： 95 ℃ 预变性5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃ 延伸1 min，循环35次；72 ℃延伸5 min。 结果判定 扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增出长度介于 700 bp～750 bp之间的清晰单一条带，与阳性 对照一致 。 9 样品复检 DB15/T 3380 —2024 3 样品检测不成功需要复检，病样置于冰箱 -20 ℃冷冻以备样品检测不成功进行复检，工作完成后集 中灭活处理。 DB15/T 3380 —2024 4 A A 附录 A （规范性） 培养配方、 DNA提取方法及发病症状 A.1 培养基配方 WA培养基：琼脂 15 g，蒸馏水定容至 1000 mL。 PDA培养基：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂15 g，蒸馏水定容至 1000 mL。 A.2 CTAB法 CTAB法如下所示： a) 将植物组织置于 2 mL离心管，加入 2颗灭菌钢珠，液氮冷冻，球磨仪研碎； b) 加入800 μL CTAB提取缓冲液， 65 ℃水浴1 h，期间每隔 15 min颠倒混匀若干次； c) 加入800 μL苯酚：氯仿：异丙醇（ 25:24:1），上下颠倒混匀， 12000 rpm 离心10 min，将 上层水相转移至新的 2 mL离心管； d) 加入等体积氯仿：异丙醇（ 24:1），上下颠倒混匀， 12000 rpm 离心10 min，将上清转移至新 的1.5 mL离心管； e) 加入0.6倍体积异丙醇， -20 ℃沉淀30 min以上； f) 12000 rpm 离心10 min，弃去上清，加入 75%乙醇洗涤两次； g) 真空干燥仪干燥 40 min左右，加水溶解 DNA。 A.3 病害症状 植株症状：苗期主要导致马铃薯根部腐烂，根部褐变，植株萎蔫，严重时根部出现白色菌丝层； 开花期前后主要导致植株萎蔫、枯萎，植株维管束出现褐变。 块茎症状：病斑多发生于薯块脐部。发病初期块茎表面出现浅褐色病斑，病斑缓慢扩展，随后扩大 形成较多轮纹状褶皱、凹陷；后期块茎内部变空，干燥时内部长满白色菌丝，整个薯 块变硬、变轻、干 缩，易碎呈灰褐色或深棕色病变。