ICS 65.020.30 CCS B 44 15 内蒙古自治区 地方 标准 DB15/T 3362—2024 瘤胃微生物 体外培养操作规程 The code of practice of in vitro culture protocol of rumen microbes 2024-02-23发布 2024-03-23实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 3362 —2024 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（ SAM/TC 19 ）归口。 本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院。 本文件主要起草人：李胜利、孙海洲、金鹿、张春华、王博、张崇志、萨初拉、刘威、杨鼎、宝华、 付乐、李文婷。 DB15/T 3362 —2024 1 瘤胃微生物体外培养操作规程 1 范围 本文件规定了瘤胃微生物体外培养的规程。 本文件适用于反刍动物瘤胃微生物体外培养。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料 采样 HJ 536 水质 氨氮的测定 水杨酸分光光度法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 试剂和材料 试剂 4.1.1 本方法所用试剂均为分析纯 ,水为 GB/T 6682 规定的一级水。 4.1.2 氯化钙CaCl 2·2H2O。 4.1.3 氯化锰MnCl 2·4H2O。 4.1.4 氯化钴CoCl 2·6H2O。 4.1.5 氯化铁FeCl 3·6H2O。 4.1.6 碳酸氢铵 NH4HCO3。 4.1.7 碳酸氢钠 NaHCO 3。 4.1.8 磷酸二氢钠 NaH2PO4·2H2O。 4.1.9 磷酸二氢钾 KH2PO4。 4.1.10 硫酸镁MgSO 4·7H2O。 4.1.11 刃天青C12H6NNaO 4。 4.1.12 硫化钠Na2S·9H2O。 4.1.13 氢氧化钠 NaOH。 试剂配制 4.2.1 瘤胃缓冲液的配制 DB15/T 3362 —2024 2 4.2.1.1 营养元素溶液 A 准确称量 氯化钙13.20 g，氯化锰 10.00 g，氯化钴 1.00 g，氯化铁 8.00 g，溶解后定容到 100 mL。 4.2.1.2 缓冲溶液 准确称取碳酸氢铵 4.00 g，碳酸氢钠 35.00 g，溶解后定容至 1000 mL。 4.2.1.3 营养元素溶液 B 准确称取磷酸二氢钠 5.70 g，磷酸二氢钾 6.20 g，硫酸镁 0.60 g，溶解后定容到 1000 mL。 4.2.1.4 刃天青溶液 将100 mg刃天青溶解到 100 mL水中。 4.2.1.5 还原剂溶液 需要现配现用，称取硫化钠 0.336 g，1M 氢氧化钠 2.0 mL，加入47.5 mL水。 5 仪器和设备 实验室用植物样品粉碎机，筛网孔径 16 目～32 目。 分析天平， 感量0.0001 g 。 干燥箱： RT+10 ℃～250 ℃，控温精度± 5 ℃。 ANKOM RFS 体外产气测量系统：模块数量 18个以上， 250 mL培养瓶。 震荡培养箱（数显水浴震荡培养箱或气浴震荡培养箱）：内径大于 30 cm×40 cm，震荡频率 0 r/min～100 r/min ，控温范围 室温至99.9 ℃，温控精度± 0.1 ℃。 pH计：测量范围 0～14，精度± 0.1。 6 操作步骤 培养底物的制备 按照GB/T 14699.1 制备培养底物，置于干燥箱内 65 ℃烘干，粉碎或研磨后过 16目筛，混匀后取 100 g～200 g装入磨口广口瓶内或封口袋内，保存备用。 瘤胃缓冲液配制 取营养元素溶液 A 0.12 mL 、缓冲溶液 237 mL、营养元素溶液 B 237 mL 、刃天青溶液 1.22 mL加入到 474 mL水中，通入 CO2至饱和，并保存在 39 ℃水浴恒温培养箱中，最后再加入 49.5 mL还原剂溶液，加 水定容至 1000 mL，继续通入 CO2直到溶液由蓝色变成无色。 瘤胃液的制备 选择健康、体重接近的 3只（头）装有永久性瘤胃瘘管的供试动物，单栏饲养。在晨饲前经瘤胃瘘 管利用瘤胃液取样器采集供试动物的瘤胃液，每只（头）动物 采集150 mL～200 mL,转入预热至 39 ℃的 保温容器中。用搅拌器搅拌 2 min，混合均匀后经 4 层纱布过滤，同时通入 CO2气体，备用。 培养装置的准备 DB15/T 3362 —2024 3 每个培养瓶中加入培养底物约 0.5 g （准确至 0.0001 g ），每种培养底物设 3个重复，每次培养设 1个空白（只有培养液无底物）。保持所有培养瓶为 39.5 ℃，每个培养瓶加入 40 mL缓冲溶液， pH调整 至6.8，调节缓冲平衡 20 min～30 min。 培养 每个培养瓶中迅速加入 20 mL瘤胃液。瘤胃培养液通入 CO2 3 min，立即拧上瓶盖， 放入39.5 ℃培 养箱内培养，培养箱 的震荡频率为 15次/分，持续培养 48 h。 7 瘤胃微生物体外培养参数测定 瘤胃微生物体外培养参数测定见附录 A，包括产气量的记录、 pH值测定、 氨氮和挥发性脂肪酸的测 定和营养物质消失率的测定。 DB15/T 3362 —2024 4 A A 附录 A （资料性） 瘤胃微生物体外培养评价参数测定 A.1 瘤胃微生物体外培养的操作 瘤胃微生物体外培养的操作包括 6个步骤见图 A.1，在瘤胃微生物体外培养过程中进行产气量的记 录，培养完成后 ，可以进行 pH值测定、氨氮和挥发性脂肪酸的测定和营养物质消失率的测定。 A.2 体外培养参数 A.2.1 产气量的记录 利用产气测量系统每隔 60 s记录产气模块内的气体压力变化，最后由样品模块内压力减去空白模 块内压力得到，计算出 0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、8 h、10 h、12 h、16 h、18 h、24 h、28 h、32 h、36 h、40 h、44 h、48 h各时间点的产气量。 A.2.2 pH值测定 发酵至48 h时，打开培养瓶采集培养液样品 10 mL，立即用 pH计测定培养液 pH值。pH值的适宜范围 为5.7～6.8。 A.2.3 氨氮和挥发性脂肪酸的测定 取20 mL上清液用 4层纱布过滤后，置于 -20 ℃冰箱保存备测氨氮和挥发性脂肪酸。氨氮按照 HJ 536 进行测定，挥发性脂肪酸采用气相色谱法测定。 A.2.4 营养物质消失率的测定 取剩余培养残渣烘干后，测定相关营养物质的含量，计算营养物质的消失率。 ………………（ A.1） 式中： Y ——代表试样中某一营养物质的消失率，单位为百分比（ %）； W1 ——培养底物中某一营养物质含量，单位为克（ g）； W2 ——残渣中某一营养物质含量，单位为克（ g）。 A.3 重复 每个培养底物称取三个平行样进行测定，取平均值为分析结果 ，同一样品平行测定结果的偏差不应 超过算术平均值的 10%。