ICS 65.020.01 CCS B 20 15 内蒙古自治区 地方 标准 DB15/T 3298—2024 苜蓿镰刀菌 根腐病室内抗性鉴定技术规程 Code of practice for identification of alfalfa resistance to Fusarium Root Rot in room 2024-01-25发布 2024-02-25实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 3298 —2024 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区林业和草原局提出并归口。 本文件起草单位：中国农业科学院草原研究所、 内蒙古自治区农牧业技术推广中心、内蒙古草业技 术创新中心有限公司、巴彦淖尔市现代农牧事业发展中心、内蒙古自治区林业和草原监测规划院。 本文件主要起草人：张园园、林克剑、贾瑞芳、陈正强、张晓萝、王乐、王圣泽、吴杰、肖皓文、 韩兆敏、张枫青、杨文 。 DB15/T 3298 —2024 1 苜蓿镰刀菌根 腐病室内抗 性鉴定技术 规程 1 范围 本文件规定了苜蓿抗镰刀菌根腐病的接种体制备、抗病性鉴定、病情调查和抗病性评价。 本文件适用于室内评价苜蓿不同品种对镰刀菌根腐病的抗性水平。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 6141 豆科草种子质量分级 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 苜蓿镰刀菌根腐病 Alfalfa Fusarium Root Rot 由镰刀菌（ Fusarium spp.）引起的土传性真菌病害，造成根和根颈部出现褐色病斑至腐烂凹陷， 开裂或剥脱，中柱红褐色至暗褐色，植株萎蔫直至死亡。 接种体 Inoculum 在实验室条件下培养的用于人工接种的病原菌繁殖体或营养体。 4 接种体制备 供试菌种 选取内蒙古苜蓿种植区发病株上分离获得的具有中等致病力的根腐病优势菌株 —锐顶镰刀菌 （Fusarium acuminatum ）。 培养基制备 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（ PDA培养基）：马铃薯 200 g，洗净去皮切成 1 cm～2 cm的小块，加水 煮沸20 min，纱布过滤，加入葡萄糖 20 g和琼脂15 g，待完全熔化后，用水定容至 1000 mL，搅拌均 匀，高压灭菌（ 121 ℃，20 min）。 麦麸培养基： 将 40 mL蒸馏水加入 60 g麦麸中拌匀， 装入三角瓶中， 高压灭菌 （ 121 ℃，30 min）。 DB15/T 3298 —2024 2 接种体繁殖 在无菌条件下将接种菌株转接于 PDA平板培养基上， 25 ℃恒温培养 3 d～5 d，自菌落边缘打取直径 6 mm菌饼3～5块，接种于灭菌的麦麸培养基上，摇匀后置于恒温培养箱 25 ℃培养7 d。 接种悬浮液制备 用200 mL～300 mL无菌水将麦麸进行淘洗，用四层纱布过滤，获得孢子悬浮母液，配制成孢子量为 5×106个/mL的悬浮液用于接种。 5 抗病性鉴定 种子质量 鉴定品种的种子质量应符合 GB 6141中苜蓿一级种标准。 育苗 将种子在 3%次氯酸钠溶液中浸泡 2 min，转至75%乙醇溶液中消毒 30 s，无菌水冲洗 5遍，播种于装 有灭菌营养土的穴盘中。置于温度 24 ℃～26 ℃，空气相对湿度 30%～40%的温室条件下，待苜蓿幼苗生 长至3～4片复叶时接种。 接种 5.3.1 接种方法 采用蘸根接种法进行接种（详见参考文献 1）。将幼苗从穴盘中取出，根系冲洗干净后完全浸泡于 接种悬浮液中， 30 min后将幼苗重新移植于装有灭菌营养土的营养钵（高 10 cm，直径10 cm）中，每钵 5株，每个处理 30株，重复三次。 5.3.2 接种后管理 将营养钵置于 24 ℃～26 ℃，光照 10 h～12 h温室条件下生长，保持基质湿润。 5.3.3 对照品种 选择高感苜蓿品种为对照材料。 6 病情调查 病情级别划分 病情级别划分见表 1（引自参考文献 2）。 表1 苜蓿镰刀菌根腐病抗性室内鉴定病情级别的划分 病情级别 代表值 症状描述 1 0 健康无症状 2 1 根颈部出现少量黑褐色、较小斑点 3 2 根颈被黑褐病斑包围 DB15/T 3298 —2024 3 表1 苜蓿镰刀菌根腐病抗性室内鉴定病情级别的划分 （续） 病情级别 代表值 症状描述 4 3 根颈缢缩变黑，出现枯叶 5 4 根颈大部分变黑变褐，大多数叶片干枯 6 5 根颈部全部腐烂，整株枯死 调查方法 接种35 d后，按病情级别调查并记录接种株发病情况，计算病情指数（ DI）。 病情指数按公式（ 1）计算： DI=∑（s×n） N×S×100…………………………………（ 1） 式中： DI——病情指数； S ——各病情级别代表数值； n ——各病情级别病株数； N ——调查总株数； S ——最高病情级别代表值。 注： 计算结果精确到小数点后两位。 7 抗病性评价 抗病性评价标准 依据病情指数（ DI）的平均值评价其抗性水平，划分标准见表 2（引自参考文献 3）。 表2 苜蓿镰刀菌根腐病抗性评定标准 病情指数 （DI） 抗病类型 DI=0 免疫（Immune，I） 0＜DI≤20 高抗（High Resistant ，HR） 20＜DI≤40 中抗（Mid-Resistant ，MR） 40＜DI≤60 中感（Mid-Susceptible ，MS） DI＞60 高感（High Susceptible ，HS） 有效性判别 对照高感品种病情指数大于 60（DI＞60），该批次根腐病抗性鉴定视为有效。 8 鉴定结果 根据本文件 6和7，将不同病情级别的株数、病情指数、 3个重复的平均病情指数、抗性评价等鉴 定结果填入附录 A。 DB15/T 3298 —2024 4 A A 附录 A （规范性） 苜蓿镰刀菌根腐病抗性鉴定结果记载表 苜蓿镰刀菌根腐病抗性鉴定结果记载见表 A.1。 表A.1 苜蓿镰刀菌根腐病抗性鉴定结果记载表 编号 品种/ 名称 送样 单位 重复 病情级别 病情 指数 平均 病情 指数 抗性 评价 0 1 2 3 4 5 Ⅰ Ⅱ Ⅲ 播种日期： 接种日期： 调查日期： 鉴定技术负责人（签字）：