ICS 65.020.30 CCS B 40 15 内蒙古自治区 地方 标准 DB15/T 1238—2024 代替DB15/T 1238-2017 绵羊肺腺瘤病毒双抗体夹心 ELISA 检测技术 Detection of double antibody sandwich ELISA for jaagsiekte sheep retrovirus (JSRV) 2024-05-31发布 2024-07-01实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 1238 —2024 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件代替 DB15/T 1238 -2017《绵羊肺腺瘤病毒双抗体夹心 ELISA检测技术》， 与 DB15/T 1238 -2017 相比，除了结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下 ： a) 增加了 “规范性引用文件 ”一章（见第 2章）； b) 增加了鼻拭子样品采集和保存（ 见7.2）； c) 更改了包被抗体（见附录 A.4，2017年版A.4）； d) 更改TMB底物显色液和终止液为商品化试剂，删除了原有的配制方法（见 5.8、5.9，2017年 版A.8、A.9）。 本文件由内蒙古自治区农牧厅 提出。 本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（ SAM/TC 19 ）归口。 本文件起草单位：内蒙古农业大学。 本文件主要起草人：刘淑英、李慧萍、张良、陈思旭、苗佳佳、刘月。 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为： —— 2017年首次发布为 DB15/T 1238 -2017； —— 本次为第一次修订。 DB15/T 1238 —2024 1 绵羊肺腺瘤病毒双抗体夹心 ELISA检测技术 1 范围 本文件规定绵羊肺腺瘤病毒双抗体夹心 ELISA检测技术的试剂、材料与设备、样品前处理、操作方 法、结果判定等。 本文件适 用于羊外周血液和鼻拭子样品中绵羊肺腺瘤病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 绵羊肺腺瘤病毒 jaagsiekte sheep retrovirus ，JSRV 引起绵羊肺腺瘤的病原，该病毒完整的囊膜蛋白具有致癌作用，位于病毒粒子的最外层，是构成病 毒粒子的主要结构蛋白。 衣壳蛋白 capsid，CA 病毒的核心蛋白，蛋白含有长约 20个氨基酸残基构成的具有高度免疫原性的结构域，且序列高度保 守，为病毒的特异抗原决定簇。 跨膜蛋白胞质尾区 transmembrane protein cytoplasmic tail ，CT 病毒囊膜蛋白中跨膜蛋白的一个功 能区，由 44个氨基酸 组成，该区域含有高度保守的 YXXM序列，能 特异性的识别外源性 JSRV。 双抗体夹心 ELISA技术 technique of double antibody sandwich ELISA DB15/T 1238 —2024 2 特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待检样品中的相应抗原结合形成免疫复合物， 洗涤后再加酶标抗体，与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体 —抗原—固相抗体复合物显色来检测抗 原及其含量的技术。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 HRP：辣根过氧化物酶（ Hydrogen -peroxide Oxidoreductase ） OD：吸光度（ Optical Delnsity) PBS：磷酸盐缓冲液（ Phosphate Buffered Saline ） PBST：Tween-20磷酸盐缓冲液洗涤 液（Phosphate Buffered Saline with Tween-20) pH：酸碱度（ Pondus Hydrogenii ） TMB：3,3',5,5' -四甲基联苯胺（ 3,3′,5,5′-Tetraethylbenzidine ） 5 试剂 除非另有说明，在检测中使用的化学试剂均为分析纯，实验室用水应符合 GB/T 6682 中三级水的 要求。 红细胞裂解液。配制按照附录 A中A.1。 抗体样品稀释液。配制按照附录 A中A.2。 包被缓冲液。配制按照附录 A中A.3。 包被抗体。配制按照附录 A中A.4。 酶标抗体。配制按照附录 A中A.5。 洗涤液。配制按照附录 A中A.6。 封闭液。配制按照附录 A中A.7。 TMB显色液。工作浓度参照所购产品说明书。 终止液。工作浓度参照所购产品说明书。 6 材料与设备 除非另有说明，实验室应符合 GB 19489 中生物安全二级实验室的要求 。 微量加样器。量程分别 0.2 μL～2 μL、1 μL～10 μL、10 μL～100 μL、20 μL～200 μL 和100 μL～1000 μL的移液器，并配备与移液器相匹配的吸头。 4 ℃、-2 0 ℃冰箱。 电热恒温培养箱。 96孔酶标板。 酶标检测仪。 旋涡振荡器。 洗板机。 计时器。 7 样品前处理 DB15/T 1238 —2024 3 动物血液按照 NY/T 541中要求进行采集和保存。取待检羊新鲜抗凝血 5 mL，3000 r/min 离心15 min，弃上清， 按 1: 5的比例向细胞沉淀中加入 4 ℃冰箱预冷的红细胞裂解液混匀， 4 ℃静置10 min， 期间上下颠倒混匀 5次，1000 r/min 离心5 min，离心弃去上层红色液体，收集沉淀部分。如果沉淀还 有红色，可重新加入红细胞裂解液，重复 1遍；向沉淀中加入样品稀释液 200 μL，反复冻融或室温静 置1 h使细胞破裂，期间在旋涡振荡器上振荡 3～5次充分混合； 1000 r/min 离心5 min，取上清液进 行检测。 鼻拭子按照 NY/T 541 中要求进行采集和保存。将采集的羊鼻拭子放到含有 1 mL青霉素-链霉素 PBS溶液（2000 IU/mL ）的10 mL离心管（ EP）中，低温运送至实验室或者 -70 ℃保存、待检。将鼻拭 子样品自然解冻之后，通过涡旋振荡器振荡 3～5次，在无菌环境中，将 EP管内液体转移到 2 mL EP管 中，4 ℃条件下 12000 r/ min离心3 min，吸取上清液进行检测。 8 操作方法 包被 96孔酶标板每孔加 100 μL包被抗体（按照附录 A.4），4 ℃，过夜。 洗涤 于滤纸上拍干 96孔酶标板孔内液体，用 PBST洗板5次，每次 3 min。 封闭 96孔酶标板每孔加入封闭液 200 μL，37 ℃，孵育 60 min。 洗涤 于滤纸上拍干 96孔酶标板孔内液体，用 PBST洗板5次，每次 3 min。 加待检样品 96孔酶标板每孔加待检样品 100 μL，37 ℃，孵育 60 min。加入阳性对照、阴性对照和 PBS空白对 照。 注： 阳性对照是经核酸检测鉴定为感染 JSRV病毒的绵羊肺腺瘤病肺组织提取蛋白，浓度不低于 0.016 mg/mL ，阴性 对照为经核酸检测鉴定为未感染 JSRV病毒的绵羊健康肺组织提取蛋白。 洗涤 于滤纸上拍干 96孔酶标板孔内液体，用 PBST洗板5次，每次 3 min。 加酶标抗体 96孔酶标板每孔加稀释过的酶标抗体 100 μL（按照附录 A.5），37 ℃，孵育 60 min。 洗涤 于滤纸上拍干 96孔酶标板孔内液体，用 PBST洗板5次，每次 3 min。 显色 96孔酶标板每孔加 TMB显色液100 μL，室温避光 15 min。 DB15/T 1238 —2024 4 终止 96孔酶标板每孔加终止液 100 μL。 读值 终止反应后将 96孔酶标板置于酶标仪上，在 450 nm波长下读取 OD值。 9 结果判断 结果分析条件设定 阳性对照平均 OD值/阴性对照平均 OD值〉2.1，空白对照平均 OD值≤阴性对照平均 OD值，检测结果有 效，否则应检查实验操作并重新检测。 阳性判定标准 被检样品 OD值/阴性对照平均 OD值≥2.1判定为阳性。 阴性判定标准 被检样品OD值与阴性对照平均 OD值〈2.1判定为阴性。