SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4647—2016 草莓疫霉红心病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Phytophthora fragariae Hickman 行业标准信息服务平台 2016-08-23发布 2017-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4647—2016 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国湖北出人境检验检疫局、中华人民共和国南沙出人境检验检疫 局、中华人民共和国吉林出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国 山东出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：王振华、叶芸、陈萍、李金甫、徐雪、魏春艳、李彬、徐家文、王英超、陈建军、曾宪东、 陈孝宇、程颖慧、郑剑。 行业标准信息服务平台 1 SN/T4647—2016 草莓疫霉红心病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了草莓疫霉红心病菌（PhytophthorafragariaeHickman）的检疫鉴定方法。 本标准适用于进出境草莓种苗的根及果实上的草莓疫霉红心病菌的检疫和鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3草莓疫霉红心病菌基本信息 学名：PhytophthorafragariaeHickman 分类地位：草莓疫霉红心病菌属藻菌界（Chromista）、卵菌门（Oomycota）、霜霉纲（Peronosporea） 霜霉目（Peronosporales）、霜霉科（Peronosporaceae）、疫霉属（Phytophthora）。Phytophthorafragariae有 2个变种：Phytophthora fragariae Hickman var.fragariaeWilcox &Duncan和Phytophthora fra gariae Hickman var. rubi Wilcox & Duncan。 草莓疫霉红心病菌的其他信息参见附录A。 4方法原理 根据草莓疫霉红心病菌在寄主上的症状、形态学特征和PCR特异性扩增片段为鉴定依据。 尔准信息服 5仪器设备和主要试剂 5.1仪器设备 生物显微镜、体视显微镜、植物生长培养箱、高速冷冻离心机、纯水仪、生物安全柜、灭菌锅、制冰机、 5.2 2主要试剂和培养基 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水应符合GB/T6682要求。 5.2.11%次氯酸钠。 5.2.2DNA提取试剂：DNA提取试剂盒。异丙醇，无水乙醇，蛋白酶K（20mg/mL），苯酚：三氯甲烷： 异戊醇（25：24：1)溶液，3mol/LNaAc(pH5.2）。 5.2.3PCR试剂:10XPCR缓冲液（含25mmol/LMgSO4）,TaqDNA聚合酶，dNTPs（dATP、 1 SN/T 4647—2016 dTTP,dCTP,dGTP)。 5.2.4凝胶电泳试剂：琼脂糖，TAE,Loading缓冲液，EB 5.2.5V8培养基：V8液100mL加人2.5g碳酸钙，15g琼脂，蒸馏水900mL，灭菌。 5.2.6玉米粉琼脂培养基（CMA）：琼脂15g，玉米粉50g，蒸馏水1000mL，调整pH至6.0，121℃， 15min灭菌。 6病菌的鉴定 6.1症状检查 取样品量1%～5%（若样品少可适量增大比例）的种苗、果实进行检查。检查根是否有根腐症状， 颜色灰色至褐色，类似“鼠尾状”，根部中柱是否由白色变成红色。植株是否矮小、萎蕉，幼叶蓝绿色，老 叶红色、橙色或黄色，结果少。果实的组织是否变褐，水渍状，成熟果实是否变软，表面是否有白色稀疏 菌丝体（参见附录A和附录B)。 6.2 2保湿培养 如根系、花蕾或病果上只有可疑病状而无明显病症，则将病根（截成2cm～5cm，从根部的端部切 离培养。 6.3分离培养和诱集 6.3.1分离培养 取具有疑似发病症状的根小段或繁殖材料，用自来水冲洗并用吸水纸吸干表面水分。用1%次氯 酸钠表面消毒1min～2min，用无菌水冲洗3次，用无菌吸水纸吸干表面水分后，放于CMA培养基上， 16℃~20℃黑暗培养7d~14d，如有真菌菌落出现，转到V8培养基上，16℃~20℃12h光照/黑暗 培养。 6.3.2卵孢子诱集 将感病的根切碎，按1：2的比例与无土的堆肥充分混合，置于1L容量的盆钵中，将12周龄的草 莓（Fragariavesca）种植进来，转人15℃的植物生长培养箱，每天18h光照，每周浇水3次。5周后， 的根部存在红心疫霉病菌（参见附录C)。 6.3.3孢子囊培养 将长有菌落得V8培养基切成小块，放在灭菌培养血中，加人少许灭菌水使培养基表面有游离水， 20℃光照培养，1d～2d后观察，如有抱子囊生成，可将培养血放置4℃，观察游动抱子产生 6.3.4卵孢子培养 取用无菌水洗过，长为15mm的根段放置在含有5mm深的无菌蒸留水的培养皿中，15℃暗处培 养2周后，观察有否卵孢子形成， 2