SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4624.9—2016 入境环保用微生物菌剂检测方法 第9部分：致泻大肠埃希氏菌 Methods for examination of import microbial blends in the environmental protectionPart 9:Diarrheogenic Escherichia coli 行业标准信息服务平台 2016-08-23发布 2017-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4624.9—2016 前言 SN/T4624《人境环保用微生物菌剂检测方法》共分为17部分： 第1部分：地衣芽孢杆菌； 第2部分：短小芽孢杆菌； 第3部分：巨大芽孢杆菌； 一第4部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌； 第5部分：β型溶血性链球菌； 第6部分：金黄色葡萄球菌； 第7部分：沙门氏菌； 第8部分：志贺氏菌； 第9部分：致泻大肠埃希氏菌； 第10部分：淡紫拟青霉； 第11部分：雅致小克银汉霉； 第12部分：哈茨木霉； 第13部分：黄孢原毛平革菌； 第14部分：焦曲霉； 第15部分：解淀粉芽孢杆菌； 第16部分：类产碱假单胞菌； 第17部分：恶臭假单胞菌。 本部分为SN/T4624的第9部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。 本部分主要起草人：李成镛、王秋艳、于丽、姜玲玲、康凯、王芳。 标准信息服务平台 1 SN/T4624.9—2016 入境环保用微生物菌剂检测方法 第9部分：致泻大肠埃希氏菌 1范围 SN/T4624的本部分规定了人境环保用微生物菌剂卫生学检验致泻大肠埃希氏菌的形态学鉴定、 生化鉴定、普通PCR、实时荧光PCR检测方法。 本部分适用于人境环保用微生物菌剂中致泻大肠埃希氏菌的检测和鉴定。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3 主要试剂和培养基 3.1 实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。 3.2 生理盐水：见附录A中A.1。 3.3 营养肉汤：见A.2。 3.4 肠道菌增菌肉汤：见A.3。 3.5 麦康凯琼脂：见A.4。 3.6 伊红美蓝琼脂：见A.5。 3.7 三糖铁琼脂：见A.6。 3.8 克氏双糖铁琼脂：见A.7。 3.9 糖发酵管（乳糖、鼠李糖、木糖和甘露醇）：见A.8。 3.10 3.11 尿素琼脂：见A.10。 3.12 氰化钾：见A.11。 3.13 蛋白陈水、靛基质试剂：见A.12。 3.14半固体琼脂：见A.13。 3.15 氧化酶试剂：见A.14。 3.16 革兰氏染色液：见A.15。 3.17 致病性大肠埃希氏菌诊断血清、侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清、产肠毒素大肠埃希氏菌诊断血 清、出血性大肠埃希氏菌诊断血清， 3.18细菌基因组DNA提取试剂盒。 3.19TE缓冲液（pH8.0):见A.16。 3.20 溶菌酶（10mg/mL）：见A.17。 3.21 蛋白酶K（20mg/mL）：见A.18。 3.22 10%SDS:见A.19。 1 SN/T4624.9—2016 3.23 3mol/L乙酸钠：见A.20。 3.24 dNTP:dATP、dTTP、dGTP、dCTP。 3.25 TBE.见A.21。 3.26 Taq DNA聚合酶。 3.27 琼脂糖。 3.28 溴化乙锭 3.29 DNA分子量标记：100bpDNAladder。 4主要仪器和设备 4.1 电子天平（感量0.01g）。 4.2恒温培养箱：36℃±1℃、42℃1℃。 4.3 恒温水浴锅。 4.4 台式冷冻离心机（最高转速15000r/min）。 4.5 PCR扩增仪。 4.6 实时荧光PCR仪。 4.7 微量移液器和灭菌吸头：10μL、20μL、200μL、1000uL。 4.8 高压灭菌锅。 4.9 ，PCR超净工作台。 4.10 电泳仪。 4.11 核酸/蛋白分析仪。 4.12 凝胶成像系统。 4.13 无菌培养皿：直径90mm。 5样品制备 以无菌操作取1g（mL）样品加人到100mL生理盐水中混匀，从中移取25mL加人到225mL灭 菌生理盐水中混匀。取样过程中在样品旁边放置1个营养琼脂平板作为空白对照。 标准信 6形态学及生化、血清学鉴定 6.1增菌 无菌条件下，移取25mL上述样品匀液至盛有225mL肠道菌增菌肉汤的无菌均质袋内，用拍击式 均质器拍打1min～2min，将上述样品匀液于42℃培养18 h～24h。 6.2分离 将增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平板，于36℃土1℃培养18h～24h，观察菌落。 不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落 6.3生化鉴定 6.3.1自鉴别平板上直接挑取数个菌落分别接种三糖铁琼脂（TSI)或克氏双糖铁琼脂（KI）。同时将这 些培养物分别接种蛋白陈水、半固体、pH7.2尿素琼脂、KCN肉汤和赖氨酸脱羧酶试验培养基。以上培 养物均在36℃培养过夜。 2