山西省市场监督管理 局 发布 山西省 地方标准 DB 14/T 3007 —2024 ICS 11.120.20 CCS C30 14 化妆品用原料 重组人源化胶原蛋白的鉴定 Identification process of recombinant humanized collagen 2024 - 05 - 29发布 2024 - 08 - 28实施 DB 14/T 3007 —2024 I 目次 前言 ................................ ................................ ........... II 1 范围 ................................ ................................ ......... 1 2 规范性引用文件 ................................ ............................... 1 3 术语和定义 ................................ ................................ ... 1 4 原理 ................................ ................................ ......... 1 5 材料和设备 ................................ ................................ ... 1 6 鉴定方法 ................................ ................................ ..... 2 7 结果判定 ................................ ................................ ..... 3 附录 A（资料性） 一种重组人源化胶原蛋白质谱鉴定结果 ............................. 4 DB 14/T 3007 —2024 II 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由 山西省药品监督管理局 提出。 本文件由 山西省化妆品标准化技术委员会 归口。 本文件起草单位：山西锦波生物医药股份有限公司， 山西省检验检测中心（山西省标准计量技术 研究院） 。 本文件主要起草人：王建、于玉凤、卢彦宏、孙丹丹、何振瑞、李喜梅、张朝敏、张永健、刘 欣。 DB 14/T 3007 —2024 1 化妆品用原料 重组人源化胶原蛋白的鉴定 1 范围 本文件适用于化妆品用原料 重组人源化胶原蛋白的鉴定。 本文件规定了化妆品用原料 重组人源化胶原蛋白的鉴定 项目、材料和设备、鉴定方法、结果判定 等。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 YY/T 1888 -2023 重组人源化胶原蛋白 中华人民共和国药典 （2020年版） 3 术语和定义 YY/T 1888 -2023 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 肽段覆盖率 （氨基酸序列覆盖度） Peptide coverage 肽段覆盖率（氨基酸序列覆盖度）是指检测到的肽段的氨基酸数量占该蛋白质总氨基酸数量的比 例。蛋白质经过酶切后，采用 LC-MS进行检测，鉴定到的酶切后肽段占理论序列氨基酸数量的比例。 3.2 末端氨基酸序列 Terminal amino acid sequence 末端氨基酸序列是指蛋白质序列中 N端和 C端的一段序列。 4 原理 选用适宜的蛋白酶对重组人源化胶原蛋白进行酶解，酶解后的肽段采用高效液相色谱 -串联质谱仪 检测肽段覆盖率和氨基酸序列。依据样品氨基酸序列与人胶原蛋白某亚型序列匹配度判断是否为重组 人源化胶原蛋白。 5 材料和设备 5.1 试剂和材料 a) 水： GB/T6682 ，一级； b) 碳酸氢铵：纯度 ≥ 99.5 %； DB 14/T 3007 —2024 2 c) 盐酸胍：纯度 ≥ 99 %； d) 二硫苏糖醇（ DTT）：纯度 ≥ 99 %； e) 碘乙酰胺（ IAM）: 纯度 ≥ 99 %； f) 甲酸：质谱级； g) 乙腈：质谱级； h) 超滤管； i) 胰蛋白酶（ Trypsin）：测序级。 注： 根据不同蛋白序列选择适合的酶进行酶切，可采用 多种酶切 综合鉴定，常用的蛋白内切酶还有 赖氨酸蛋白酶 （Lys-C）、谷氨酰蛋白内切酶（ Glu-C）、天冬氨酸蛋白酶（ Asp-N）等。 5.2 试剂配制 5.2.1 碳酸氢铵溶液（ 50 mmol/L ）：准确称取 0.395 g碳酸氢铵定容于 100 mL水中，混匀。 5.2.2 盐酸胍溶液（ 6 mol/L）：准确称取 28.66 g盐酸胍定容于 50 mL的碳酸氢铵溶液（ 5.2.1） 中，混匀（现用现配）。 5.2.3 DDT溶液（ 1 mol/L）：准确称取 0.154 g二硫苏糖醇溶于盐酸胍溶液（ 5.2.2）中，混匀 （现用现配）。 5.2.4 IAM溶液（ 1 mol/L）：准确称取 0.185 g IAM 溶于 1 mL 盐酸胍溶液（ 5.2.2）中，混匀后 避光放置（现用现配）。 5.2.5 Trypsin溶液（ 0.2 μg/μL ）：准确称取 20 μg Trypsin ，溶于 100 μL水中，混匀。 5.2.6 0.1 %甲酸水溶液：取 1 mL甲酸加水定容至 1000 mL, 混匀。 5.2.7 0.1 %甲酸乙腈溶液：取 500 μL甲酸定容于 500mL乙腈中，混匀。 5.3 仪器设备 5.3.1 高效液相色谱 -串联四极杆飞行时间质谱 仪:配有电喷雾离子源 （ESI）。 5.3.2 高速冷冻 离心机：转速不低于 12000 r/min 。 5.3.3 分析天平： 感量 0.0001 g。 5.3.4 水浴锅：温度均匀度 ± 0.3 ℃。 5.3.5 涡旋振荡器 。 6 鉴定方法 6.1 样品处理 1) 取100 μ L重组人源化胶原 蛋白溶液 (1 μg/μL)置于超滤管接收管中， 12000 r/min 离心 15 min； 2) 变性：加入 100 μ L盐酸胍溶液（ 5.2.2）； 3) 还原：加入 2 μL DTT溶液（ 5.2.3） ，涡旋震荡使蛋白均匀分布于溶液中， 42 ℃孵育 1 h； 4) 烷基化处理：超滤管接收管中加入 5μL IAM溶液（ 5.2.4） ，涡旋震荡使蛋白均匀分布于溶液 中，避光室温放置 30 min，14000 g离心 15 min； 5) 置换溶液：接收管中加入 100 μ L碳酸氢铵溶液（ 5.2.1），12000 r/min 离心 15 min，重复两次； 6) 酶切：将接收管取出置于新的超滤管中，再加入碳酸氢铵溶液（ 5.2.1）100 μ L，0.2 Trypsin 溶 液（ 5.2.5）15 μL，旋涡震荡，使蛋白溶液均匀分布； 7) 封口膜封好放置于 37 ℃孵育 18小时； 8) 将超滤管倒置离心，收集溶液。 DB 14/T 3007 —2024 3 6.2 仪器条件 6.2.1 高效液相色谱参考条件 a) 色谱柱： C18， 150*2.1 mm （内径），粒度 1.6 μm，或相当者； b) 流动相 A：0.1 %甲酸水溶液（ 5.2.6）； c) 流动相 B：0.1 %甲酸乙腈溶液（ 5.2.7）； d) 流速： 0.2 mL/min ； e) 柱温： 40 ℃； f) 进样体积： 4 μL； g) 流动相梯度洗脱程序见表 1。 表1 色谱分离梯度 时间（ min） A （%） B（%） 0 98 2 1 98 2 17 70 30 20 55 45 21 5 95 25 5 95 25.1 98 2 30 98 2 6.2.2 质谱参考条件 a) 离子源： ESI； b) 检测方式：正离子模式； c) MS扫描范围 200 - 2000 m/z； d) MS/MS扫描范围 50 - 2500 m/z。 6.3 数据分析 产生的原始数据及图谱由数据分析软件识别标峰并导出对应图谱，通过质谱数据和相关质谱鉴定 图谱进行数据库匹配，得出肽段覆盖率 及末端氨基酸序列 鉴定结果 （具体示例见附录 A中A.1及A. 2）。 7 结果判定 样品检测出的 氨基酸序列 需与理论氨基酸序列一致 ，肽段覆盖率 需达到 100%。将氨基酸序列检测 结果和人胶原蛋白某亚型序列 进行比对，判断样品是否为重组人源化胶原蛋白 (具体比对示例见附录 A 中A.3）。 将样品检测出的氨基酸序列与 人胶原蛋