ICS 65.020.01 CCS B05 1310 廊坊市 地方标准 DB 1310/T 345—2024 平菇液体菌种制备技术规范 2024 - 06 - 28发布 2024 - 07 - 28实施 廊坊市市场监督 管理局 发布 DB 1310/T 345 —2024 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由廊坊市农业农村局提出。 本文件起草单位：廊坊市森淼春食用菌有限公司、廊坊师范学院、献县农业农村局、廊坊市自然资 源与规划局、廊坊市农业农村局。 本文件主要起草人：周志国、陈文杰、解春艳、王艳、侯桂森、任思竹、付强、闫训友、史振霞、 张瑞青、杜伟娜、王素霞、乔丽秀、李春叶。 DB 1310/T 345 —2024 1 平菇液体菌种制备技术规范 1 范围 本文件规定了平菇液体菌种的基本要求、生产技术和生产档案等要求。 本文件适用于平菇液体菌种的制备。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 150 压力容器 GB 5749 生活饮用水卫生标准 GB 19172 平菇菌种 GB 50073 洁净厂房设计规范 GB/T 4789.28 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求 GB/T 12728 食用菌术语 NY/T 528 食用菌菌种生产技术规程 3 术语和定义 GB/T 12728界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 液体菌种 在生物发酵罐中通过深层培养 (液体发酵 )技术生产的液体形态的食用菌菌种。 母种 经各种方法选育得到的具有结实性的菌丝体纯培养物及其继代培养物，以玻璃试管为培养容器和 单位，也称一级种、试管种。 液体菌种菌龄 菌种接入培养基开始计算的液体菌种培养时间。 发酵罐空消 对尚未加水投料的空发酵罐进行高压灭菌。 发酵罐实消 指对投料后的发酵罐进行高压蒸汽灭菌。 DB 1310/T 345 —2024 2 通气量 单位时间通入发酵罐中无菌空气体积与发酵罐体积的比值。 菌种活力 菌种的生长、繁殖能力。 4 基本要求 人员要求 工作人员应该保持个人卫生，进液体菌种发酵车间须穿戴经灭菌处理的工作服、口罩、鞋、帽。 场所要求 生产场所符合 NY/T 528 的环境卫生要求，场地开阔、路面硬化、卫生清洁。生产用水应符合 GB 5749 要求。 厂房及设施要求 厂房设计应符合 NY/T 528 要求。洁净车间应设有多功能实验室、菌种保藏室、无菌接种室、摇瓶 室、发酵罐室，设计符合 GB 50073 要求。 生产设备要求 具有磅秤、量筒、量杯、天平、高压蒸汽灭菌锅、发酵罐、液体菌种接种器、超净工作台、调温设 备、恒温培养箱、恒温摇床或磁力搅拌器、冰箱、显微镜等及其它常规用具。压力容器应每年经政府有 关部门检验合格，符合 GB 150要求。具有备用电源。 5 生产技术 工艺流程 工艺流程步骤如图 1所示。 图1 工艺流程 步骤 DB 1310/T 345 —2024 3 母种活化 母种活化配方及操作流程应符合 NY/T 528 要求。活化后母种质量应符合 GB 19172 要求。 摇瓶液体菌种生产 5.3.1 容器 使用无色或近无色专用玻璃三角甁做摇瓶 ,使用硅胶塞或专用封口透气膜进行封口。 5.3.2 培养基配方 生产用水应符合 GB 5749要求，培养基质应符合 NY/T 528 要求，玉米粉过 30目筛。其中 ，培养基配 方根据成分不同，分为 配方1和配方2： —— 配方1：葡萄糖 20 g，蛋白胨 5 g，酵母膏 2 g，磷酸二氢钾 1 g，硫酸镁 0.5 g，维生素 B1 10 mg，水1 L，pH 6.0～6.5； —— 配方2：玉米粉 10 g，葡萄糖 20 g，酵母膏 5 g，牛肉膏 2 g，磷酸二氢钾 2 g，硫酸镁 1 g， 维生素B1 10 mg，水1 L，pH 6.0～6.5。 5.3.3 培养基配制 按液体培养基配方配制，玉米粉先用温水搅拌均匀，装入摇瓶中，混合均匀，装液量为摇甁容量的 2/5～3/5，并用专用封口透气膜或硅胶塞封口。 5.3.4 灭菌 将分装好的摇瓶放入灭菌锅内，采用高压灭菌，灭菌温度控制在 121 ℃～122 ℃，维持 25 min～30 min。 5.3.5 接种 灭菌后的摇瓶冷却到室温，无菌接种，接种 7块～8块规格为（ 3～4）mm×（3～4）mm×（1～2）mm 的母种块于摇瓶培养基内，菌种块菌丝面朝上。 5.3.6 摇瓶菌种培养 接种结束后封口，放入恒温箱中 23 ℃～25 ℃静置培养 24 h，然后置于摇床上震荡培养，摇床温度 控制在25 ℃±1 ℃，转速 180 r/min，摇床培养 5 d～6 d。培养全过程要求无光或弱光培养。 5.3.7 摇瓶菌种质量标准 培养液澄清透明，无杂菌；镜检无杂菌、菌丝形态正常；菌丝球、菌丝片段密集，静置 1 h后菌丝体 体积不低于整个培养液体积的 80%，均匀悬浮于液体培养基中不分层。 发酵罐液体菌种生产 5.4.1 煮罐、空消 发酵罐初次使用、出现杂菌、长期放置、更换品种等情况出现其一时，应煮罐和空消，煮罐操作 步 骤：在发酵罐中充满水，通蒸汽加热到 100 ℃，煮沸 1 h，之后冷却。注意冷却过程中保持罐内外及夹DB 1310/T 345 —2024 4 层内外空气流通，以防罐体受压损伤。空消操作 步骤：排净发酵罐中的水，直接在发酵罐中通蒸汽，温 度126 ℃，维持 40 min～60 min。 5.4.2 发酵罐液体菌种培养基配方 生产用水应符合 GB 5749要求，培养基质应符合 NY/T 528 要求，玉米粉过 30目筛。其中，培养基配 方根据成分不同，分为配方 1和配方2： —— 配方1：玉米粉 8 g，葡萄糖 15 g，酵母膏 3 g，牛肉膏 2 g，磷酸二氢钾 2 g，硫酸镁 1 g，维 生素B1 10 mg，泡敌0.4 g，水1 L，pH 6.0～6.5； —— 配方2：玉米粉 10 g，麦麸20 g（煮汁），葡萄糖 15 g，蛋白胨 3 g，磷酸二氢钾 2 g，硫酸 镁1 g，泡敌0.4 g，水1 L，pH 6.0～6.5。 5.4.3 投料和定容 用温水把 玉米粉等原料搅拌均匀，混合后加入罐体，装液量为罐体容量的 60%～70%，加入0.4‰泡 敌做为消泡剂，通入空气鼓气搅拌 1 min～2 min，混合均匀，拧紧上料口盖。 5.4.4 发酵罐实消 发酵罐通入蒸汽加热。待罐压达到 0.05 MPa时，缓慢打开排气阀降压至 0 MPa排净冷空气，关闭排气 阀， 通蒸汽升压至 0.11 MPa， 维持80 min～90 min。 在位灭菌的空气过滤器要通过阀门通蒸汽灭菌 30 min， 其他与外界有流通的阀门开口如取样口、排污口、接种口等均要通蒸汽 30 min灭菌。 5.4.5 冷却 灭菌结束，关闭空气过滤器灭菌阀与排气阀，缓慢打开空气过滤器排水阀降压至 0 MPa，夹层通入 冷水降温；同时缓慢打开发酵罐排气阀降压，待压力接近 0.01 MPa时通过空气过滤器向培养层内通入无 菌空气，调整排气阀，维持罐压 0.04 MPa～0.05 MPa，培养液温度降至 25 ℃时，关闭夹层进水阀。 5.4.6 接种 接入摇甁菌种，接种量为 0.5‰～1‰。将摇瓶接种管和发酵罐外接种口用 75%酒精消毒，用 95%酒精 的火焰圈套在接种口上，使发酵罐压力为 0.01 MPa，并有气体排出。点燃火焰圈，在火焰保护下将摇瓶 菌种倒入发酵罐接 种口，盖上接种口盖子，去掉火焰圈，拧紧接种口盖。 5.4.7 发酵罐菌种培养 根据菌丝生长情况，适时调节进气按钮，调节通气量，通入适量无菌空气，同时调节排气阀，维持 罐压0.03 MPa～0.05 MPa，培养温度控制在 23 ℃～25 ℃，培养 6 d～7 d。 5.4.8 发酵罐液体菌种质量标准 平菇发酵罐液体菌种感官见表 1。 DB 1310/T 345 —2024 5 表1 平菇发酵罐液体菌种感官要求 项目 要求 菌液色泽 菌丝球或菌丝片段呈白色，菌液呈浅棕色 菌液形态 培养液澄清透明，菌丝球、菌丝片段均匀悬浮于液体中，不分层，直径小于 3.5 mm 菌液气味 有平菇液体培养时特有的香气，无酸、臭等异味，发酵罐排气口气味正常，无明显改变 显微镜下 菌丝形态 可见平菇菌种液体培养中特有的菌丝形态，菌丝粗壮，分支较少，无杂菌 pH 5.3～6.0 菌丝湿重（ g/mL） 0.2～0.25 菌种活力检测 菌丝日平均生长速度不低于 0.5 cm 霉菌 无 细菌 无 5.4.9 发酵罐液体菌种检测 发酵罐液体菌种检测方法如下： —— 形态学观察：主要是通过肉眼观察菌球形态，包括菌液色泽、菌液形态、通过鼻嗅检测菌液