ICS 65.020.20 CCS B 05 13 河北省 地 方 标 准 DB 13/T 6010—2024 番茄抗病种质资源一年多代快速培育 技术规程 2024 - 10 - 28发布 2024 - 11 - 28实施 河北省市场 监督管理局 发布 DB 13/T 6010 —2024 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 本文件由河北省农业农村厅提出。 本文件起草单位：河北省农林科学院经济作物研究所、河北省农业项目规划中心 。 本文件主要起草人：李亚栋、吴志明、杨靖、田哲娟、康忱、高亢、高慧敏。 DB 13/T 6010 —2024 1 番茄抗病种质资源一年多代快速培育技术规程 1 范围 本文件规定了番茄抗病种质资源一年多代快速培育的前期准备、 幼胚成苗、 分子标记辅助选择、 种植期温光调控等技术要求。 本文件适用于番茄抗病种质资源一年多代的快速培育。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件： KASP：竞争性等位基因特异性 PCR（Kompe titive Allele Specific PCR ） SDS：十二烷基硫酸钠（ Sodium dodecyl sulfate ） TYLCVD ：黄化曲叶病毒病（ Tomato yellow leaf curl virus disease ） ToMVD：番茄花叶病毒病（ Tomato mosaic virus disease ） TSWVD：番茄斑萎病毒病（ Tomato spotted wilt virus disease ） FCRR：镰刀菌颈腐根腐病（ Fusarium crown and root rot disease ） RKN：根结线虫（ Root -knot nematode ） 5 前期准备 5.1 仪器、药品 超净工作台、荧光定量 PCR仪、荧光定量 PCR试剂盒等，其他常用实验仪器、药品见附录Ａ。 5.2 番茄种植所需设施、生产资料 5.2.1 主要设施 光照培养室、人工气候室或日光温室。 5.2.2 生产资料 育苗基质、 穴盘、穴盘托等， 有机肥、复合肥、磷酸二氢钾等常用肥料，百菌清、吡虫啉、菊酯 类等常用抑菌防虫药物。 6 幼胚成苗 6.1 果实采集 从番茄植株上采集授粉后 25 d的果实备用。 6.2 幼胚采集 6.2.1 果实表面消毒 DB 13/T 6010 —2024 2 在超净工作台内，将采集的果实浸泡在 75%的酒精中 10 min进行表面消毒。 6.2.2 取幼胚 用消毒后的手术刀切开果皮，从果肉中将未成熟种子自胎座上剥离。 6.2.3 清洗 用灭菌的蒸馏水洗去未成熟种子表面的果肉残渣。 6.3 幼胚培养 将清洗过的未成熟种子平铺在 1/2MS培养基上，放置于温度 28 ℃、光照/黑暗=16h/8 h 的条件 下培养约 5 d。 6.4 移栽炼苗 将发芽种子移栽到穴盘内，加透明罩子保湿。 7 d后打开罩子炼苗，幼苗生长至三叶一心期，备 用。 7 分子标记辅助选择 7.1 DNA提取 采集番茄幼苗叶片，采用常规的 SDS方法或商业试剂盒提取 DNA。 7.2 分子标记检测 7.2.1 主要抗病基因的分子标记引物 针对番茄 TYLCVD、ToMVD、TSWVD、FCRR和RKN等病害， 应用表1给出的KASP引物，对番茄种质资源 的抗病基因进行分子标记检测。 表1 KASP引物及基因分型判断标准 抗病基因 引物名称 引物序列（ 5′–3′） 等位基因 抗病类型 Ty-1 Ty-1-Allele-F1 GAAGGTCGGAGTCAACGGATT GAATATGGTAAAGGTGCATCCAGA A : A 抗病 Ty-1-Allele-F2 GAAGGTGACCAAGTTCATGCT GAATATGGTAAAGGTGCATCCAGT T : T 感病 Ty-1-R CCGTTGATTGAAGAAATTGATG Mi-1 Mi-1-Allele-R1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCT GATGTTTACAAGTATTTGTGGCG G : G 抗病 Mi-1-Allele-R2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATT GATGTTTACAAGTATTTGTGGCA A : A 感病 Mi-1-F TTCAGACGAAGTTAGACATAAAGGA Tm-22 Tm-2-Allele-F1 GAAGGTCGGAGTCAACGGATT CAATATGCTACAAGCCAAATTACTC C : C 感病 Tm-2-Allele-F2 GAAGGTGACCAAGTTCATGCT CAATATGCTACAAGCCAAATTACTT T : T 抗病 Tm-2-R GAAACAACTCCATAATGCAAATC Frl Frl-Allele-F1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCT TAAAGGACCATTTTTCGTAGACCATT T : T 感病 Frl-Allele-F2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATT TAAAGGACCATTTTTCGTAGACCATA A : A 抗病 Frl-R ATTTCTTACCATATGTGAAGAGAA Sw-5 FP1SNP724 GAAGGTCGGAGTCAACGGATT CATGGACACAACTGGAGTTATTA A : A 感病 FP2SNP724 GAAGGTGACCAAGTTCATGCT CATGGACACAACTGGAGTTATTG G : G 抗病 RPSNP724 CAGTCATTCTTCAAATTTTACTTGT 注： 下划线部分为 FAM荧光标签序列；双下划线部分为 HEX荧光标签序列。 7.2.2 KASP检测技术 7.2.2.1 反应体系 DB 13/T 6010 —2024 3 总体积为 5 μL：PCR Mix（2×）2.5 μL，DNA溶液（40 ng～50 ng · μL-1）0.5 μL，正向引物 1（10 μmol · L-1）0.075 μL，正向引物 2（10 μmol · L-1）0.075 μL，反向引物（ 10 μmol · L-1）0.2 μL，加 ddH2O补至5 μL。 7.2.2.2 反应程序 94 ℃ 15 min；94 ℃ 20 s，65 ℃ 1 min（10个循环， 每循环下降 0.8 ℃）；94 ℃ 20 s，57 ℃ 1 min， 共24个循环； 57 ℃ 1 min。终点法采集荧光信号。 7.2.2.3 检测结果 依据表1的判断标准，将基因型分为纯合抗病、纯合感病和杂合型，选择符合育种目标的番茄 幼苗。以 Ty-1为例，基因分型结果见图 1。 图1 Ty-1 抗病基因检测结果分型 8 种植期温光调控 8.1 定植后管理 于三叶一心期进行幼苗移栽， 白天温度 22℃～24℃， 夜间14℃～16℃； 光照时间为 12 h～14 h， 配置LED植物生长灯红蓝光 (1R1B)：远红光 =3：1，光通量密度 100±10 μmol/m2·s。保持14 d～18 d， 至第一穗花现蕾。 8.2 现蕾后管理 白天温度 24℃～26℃，夜间18℃～20℃。光照时间为 13 h～15 h，配置LED植物生长灯白光：远 红光=3：1，光通量密度 120±10 μmol/m2·s。保持8 d～10 d，至第一穗花可人工授粉。 8.3 开花后管理 人工授粉后，白天温度 28℃～30℃，夜间 18℃～20℃。光照时间为 14h～16 h，配置LED植物生 长灯白光或继续保持白光：远红光 =3：1，光通量密度 100±10 μmol/m2·s。25天后，取果实进行下 一世代幼胚培养。 DB 13/T 6010 —2024 4 A A 附录 A （资料性） 实验室常用仪器、器具及药品 A.1 实验室常用仪器、器具及药品 高温高压灭菌锅、移液器、称量天平、冰箱 (4 ℃,-20 ℃, -80 ℃)、pH测量仪、镊子、组培瓶、 酒精灯，以及 MS培养基、蒸馏水、琼脂粉等。 1/2MS培养基的配置：称取 4.43 g MS粉、30 g蔗糖和7.5 g琼脂粉，加水 800 mL充分溶解后，定容 至2 L，调节pH至5.8，分装在 500 mL锥形瓶中，高温高压灭菌 20 min备用。