ICS 65.020.30 CCS B 43 12 天津市 地方 标准 DB12/T 1328—2024 畜禽养殖粪污中典型致病菌检测 三重数字 PCR法 Detection of typical pathogenic bacteria in livestock waste —Triple digital PCR method 2024 - 07 - 01发布 2024 - 09 - 01实施 天津市市场监督管理委员会 发布 DB12/T 1328 —2024 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由天津市农业农村委员会提出并归口。 本文件起草单位：农业农村部环境保护科研监测所、天津市动物疫病预防控制中心、新疆农垦科学 院、天津市农业科学院 。 本文件主要起草人： 杜连柱、程深伟、张克强、梁雨、王健春、尹春博、刘福元、郜兴亮、杨井泉 、 苏蘩。 DB12/T 1328 —2024 1 畜禽养殖粪污中典型致病菌检测 三重数字 PCR法 1 范围 本文件规定了畜禽养殖粪污中 典型致病菌 的三重数字 PCR检测方法 的原理、试剂和材料、仪器设 备、操作步骤、结果 分析与表述 及生物安全 措施。 本文件适用于天津市畜禽养殖粪污中 金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌 O157:H7、沙门氏菌 的快速定 量检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 —2008 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 —2008 实验室 生物安全通用要求 GB/T 25171 —2023 畜禽养殖环境与废弃物管理术语 GB/T 27403 —2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 GB/T 27522 —2023 畜禽养殖污水 监测技术规范 SN/T 4853 转基因大米定量检测 数字PCR法 SN/T 5334.1 —2020 转基因植物产品的数字 PCR检测方法 第1部分：通用要求与定义 3 术语和定义 GB/T 25171 —2023、SN/T 5334.1 —2020界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 微滴式数字 PCR系统采用毛细通道网格将 数万个微滴离散进入 2D芯片，从而有效地实现反应体系的 精准分割。该系统利用金黄色葡萄球菌的 nuc、大肠埃希氏菌 O157:H7的rfbE以及沙门氏菌的 FimY特异性 基因序列对畜禽养殖粪污中典型致病菌进行检测。在 PCR扩增后，通过泊松分布校正阳性微滴的数量和 比例，可以准确计算靶基因序列的起始拷贝数或浓度，从而同时实现对三种病原体的快速定量检测。 5 仪器和设备 所需仪器和设备 如下： a） 微滴生成系统； b） PCR仪； c） 微滴阅读分析系统； d） 高速冷冻离心机 ：控温 4℃8℃，离心力不小于 12 000 g /min； e） 分析天平： 精度 0.01 g； DB12/T 1328 —2024 2 f） 恒温水浴箱 ：95℃±1℃ ； g） 湿热高压蒸汽灭菌器； h） 恒温振荡摇床：控温 28℃±1℃37℃±1℃，转速在 125 r/min 250 r/min ； i） 生物安全柜； j） 组织研磨仪； k） 冰箱：控温 0℃4 ℃； l） 超低温冰箱：控温 -20℃-80 ℃； m） 微量移液器： 0.5μL10μL，20μL200μL，100μL1000μL； n） 超微量紫外分光光度计； o） 无菌离心管： 1.5 mL，15 mL，50 mL。 6 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯 。实验用水 应符合GB/T 6682—2008规定的一级水。 6.1 所需试剂和材料如下： 6.2 a) 5×dPCR 预混液； b) 溶菌酶； c) 裂解液： 2% CTAB(cetyltrithylammonium bromide ，十六烷基三甲基溴化铵 )，100 mmol/L Tris(tris hydroxymethyl aminomethane ，三羟甲基氨基甲烷 )，1.4 mol/L NaCl ，20 mmol/L EDTA(ethylene diaminetetraacetic acid ，乙二胺四乙酸 )，用HCl调至pH 8.0； d) 无水乙醇 ； e) 异丙醇； f) DNA off 防核酸污染用剂 ； g) 荧光素钠盐 。 引物和探针 6.3 6.3.1 金黄色葡萄球菌 nuc基因引物和探针 nuc上游引物： 5’- CCTGAAGCAAGTGCATTTACGA -3’ nuc下游引物： 5’- CTTTAGCCAAGCCTTGACGAACT -3’ nuc探针：5’-（HEX）- TGGACGTGGCTTAGCGTATATTTATGCTGATG -（BHQ1）-3’ 6.3.2 大肠埃希氏菌 O157:H7 rfbE基因引物和探针 rfbE上游引物： 5’- TCAAAAGGAAACTATATTCAGAAGTTTGA -3’ rfbE下游引物： 5’- CGATATACCTAACGCTAACAAAGCTAA -3’ rfbE探针：5’-（CY5）- AATAAATTTGCGGAACAAAACCATGTGCAA -（BHQ3）-3’ 6.3.3 沙门氏菌的 FimY基因引物和探针 FimY上游引物： 5’- GCGGCGTTGGAGAGTGATA -3’ FimY下游引物： 5’- AGCAATGGAAAAAGCAGGATG -3’ FimY探针：5’-（FAM）- CATTTCTTAAACGGCGGTGTCTTTCCCT -（BHQ1）-3’ 7 操作步骤 DB12/T 1328 —2024 3 采样物品 7.1 采样容器 应经121℃、20 min高压灭菌 或使用一次性无菌器具 。其余采用所用工具、 文具和安全 防 护用品等 应按照GB/T 27522 —2023中第7章规定执行。 采样方法 7.2 参照GB/T 36197 进行畜禽养殖粪污样品的采集。 样品运输与保存 7.3 样品在运输过程中应 4℃以下保存并及时送达实验室检测。如当日送样不能及时检测，应将样品放 入0℃~4℃冰箱保存， 放置时间不超过 24 h。 若长期保存， 应放置于 -80℃冻存。保存期间避免反复冻融。 DNA的制备 7.4 按照7.1-7.3采集的畜禽养殖粪污，称取 3.0 g，加入到含有 5 mL裂解液的 15 mL无菌离心管中 ， 并使用组织研磨仪充分混匀 。将离心管移至 95℃恒温水浴锅中孵育 15 min，孵育期间振荡 2次3次。 12000 g/min ，4℃8℃低温离心10 min，转移上清液至新的离心管中 。加入等体积氯仿，混匀后， 12 000 g/min，4℃8℃低温离心5 min。吸取上清至新的无菌离心管中， 加入 0.6倍体积预冷的异丙醇 ，混匀。 12 000 g/min，4℃8℃低温离心5 min，轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体 。加入500μL 75%乙醇，颠倒洗涤 ，12000 g/min ，4℃8℃低温离心5 min弃去上清，晾干 。沉淀溶于 20μL 一级水 中，保存在-20℃备用。阳性对照样品也 应采取上述 DNA制备形式。 整体操作步骤也可以 使用等效商品 化DNA提取试剂盒并按其说明书制备模板 DNA。 DNA浓度的测量 7.5 DNA浓度的测量方法和对 DNA模板浓度的要求应符合 SN/T 4853 的规定。 三重数字 PCR反应体系 7.6 在试剂配制区进行 ddPCR体系配置 。畜禽养殖粪污中 同时检测 金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌 O157:H7、沙门氏菌 的三重数字 PCR检测体系见表 1（25 L反应体系 ）： 表1 数字PCR反应体系 试剂成分 体积（μL） 5×dPCR 预混液 5.0 nuc上游引物（ 10μmol/L） 1.0 nuc下游引物（ 10μmol/L） 1.0 nuc探针（10μmol/L） 0.5 rfbE上游引物（ 10μmol/L） 1.0 rfbE下游引物（ 10μmol/L） 1.0 rfbE探针（10μmol/L） 0.5 FimY上游引物（ 10μmol/L） 1.0 DB12/T 1328 —2024 4 FimY下游引物（ 10μmol/L） 1.0 FimY探针（10μmol/L） 0.5 DNA模板（1100 ng/μL） 5.0 一级水 5.0 荧光素钠盐 （1μmol/L） 2.5 对照和平行 7.7 每次检测应设置空白对照和阳性对照。 空白对照 （阴性对照）用 一级水替代样品 DNA。 阳性对照 采用阳性 质粒标准品。 每个待检样品提取的 DNA溶液以及空白和阳性对照都应 进行3个平行样本的检测。 阳性标准品：含有金黄色葡萄球菌