ICS 13.020.99 CCS Z 06 DB 11 北京市地方标准 DB11/T 2358—2024 淡水大型底栖无脊椎动物环境 DNA监测 技术规范 Technical specification for environmental DNA monitoring of freshwater benthic macroinvertebrates 2024 - 12 - 25发布 2025 - 04 - 01实施 北京市市场监督管理局 发布 DB11/T 2358—2024 I 目次 前言 ........................................................................... II 1 范围................................................................................. 1 2 规范性引用文件 ....................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................... 1 4 环境DNA监测原则及流程 ............................................................... 2 5 试剂................................................................................. 3 6 仪器设备和材料 ....................................................................... 5 7 样品................................................................................. 5 8 分析步骤 ............................................................................. 6 9 结果分析 ............................................................................. 7 10 质量保证和质量控制 .................................................................. 8 11 废物处置 ............................................................................ 9 附录 A （资料性） 淡水大型底栖无脊椎动物常用扩增引物 ............................. 10 附录 B （资料性） 环境DNA采样记录表 ............................................. 11 附录 C （资料性） 沉积物样品采集和前处理 ......................................... 12 附录 D （资料性） 淡水大型底栖无脊椎动物环境 DNA监测结果记录表 ................... 13 参考文献 .............................................................................. 14 DB11/T 2358—2024 II 前言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起 草规则》的规定 起草。 本文件由北京市生态环境局提出并归口。 本文件由北京市生态环境局组织实施。 本文件起草单位：北京市生态环境监测中心、中国科学院生态 环境研究中心。 本文件主要起草人：常淼、沈秀娥、孙成华、杜泽瑞、陈圆圆、战爱斌、熊薇、陈 义永、马秋月、 贺鑫、荆红卫、陶蕾、刘康、任帅、晁晶迪。 DB11/T 2358—2024 1 淡水大型底栖无脊椎动物环境 DNA监测技术规范 1 范围 本文件规定了淡水大型底栖无脊椎动物环境 DNA监测的监测原则及流程 、试剂、仪器设备和材料、 监测点位布设、监测频次和时间、样品采集、实验分析、结果分析、质量保证和质量控制 等技术要求。 本文件适用于河流、湖泊、水库等淡水水体中大型底栖无脊椎动物环境 DNA的监测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 30989 高通量基因测序技术规程 GB/T 40226 环境微生物宏基因组检测 高通量测序法 HJ 91.2 地表水环境质量监测 技术规范 HJ 1295 水生态监测技术指南 河流水生生物监测与评价（试行） HJ 1296 水生态监测技术指南 湖泊和水库水生生物监测与评价（试行） DB11/T 2023 鱼类贝类环境DNA识别技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 淡水大型底栖无脊椎动物 freshwater benthic macroinvertebrates 生活史的全部或至少一个时期栖息于内陆淡水水体的水底中且个体不能通过500 μm孔径网筛的无 脊椎动物。主要包括刺胞动物门（Cnidaria）或称腔肠动物门（Coelenterata）、扁形动物门 （Platyhelminthes）、线形动物门（Nematomorpha）、线虫动物门（Nematoda）、环节动物门（Annelida）、 软体动物门（Mollusca）、节肢动物门（Arthropoda）的动物。 [来源：HJ 710.8—2014，3.1、3.2，有修改 ] 3.2 环境DNA environmental DNA （eDNA） 从生物生活环境中直接提取到的不同物种DNA的总和，包含生物脱落、释放的细胞或游离的DNA。 [来源：DB11/T 2023—2022，3.3，有修改 ] 3.3 高通量测序 high-throughput sequencing （HTS） 区别于传统双脱氧链末端终止法（Sanger）测序，能够一次并行对大量核酸分子进行平行序列测定 的技术。 [来源：GB/T 30989—2014，3.19，有修改 ] DB11/T 2358—2024 2 3.4 DNA条形码 DNA barcode 一段标准的、短小的、易于PCR扩增的、物种间有足够变异且物种内相对保守的、能够代表该物种 的基因序列。本文件选用淡水大型底栖无脊椎动物常用的 后生动物线粒体基因组上的DNA序列作为目标 序列。 3.5 eDNA宏条形码技术 eDNA metabarcoding technology 利用高通量测序技术获取环境样品（如水、沉积物等）中的目标基因序列，根据物种间特定DNA序 列差异识别物种，获取物种组成的技术。 3.6 序列相似值 sequence similarity 反映序列间相似程度的数值，即序列间相同DNA碱基数目所占的比例，一般以百分数表示。 [来源：SN/T 4278—2015，3.8，有修改 ] 3.7 序列相似度阈值 cutoff value of sequence similarity 判定两条DNA序列是否为同一操作分类单元的最小序列相似值。 3.8 操作分类单元 operational taxonomic unit (OTU) 测序数据按照一定的序列相似度阈值进行聚类，获得的用于表征物种的分子水平的分类单元。 3.9 相对序列丰度 relative sequence abundance 样品中分配到某一分类阶元的序列数占该样品序列总数的比例。 [来源：GB/T 40226—2021，3.2，有修改 ] 3.10 阴性对照 negative control 不含待测物种或者所有物种DNA的样品（如灭菌超纯水），与待测样品同步实验，用于判断待测样 品是否被污染。 [来源：SN/T 4278—2015，3.7，有修改 ] 3.11 阳性对照 positive control 已知物种组成的基因组DNA或人工合成含有目标序列的DNA片段的混合物，与待测样品同步实验，用 于判断结果是否可靠。 [来源：SN/T 4278—2015，3.6，有修改 ] 4 环境DNA监测原则及流程 4.1 监测原则 4.1.1 科学性原则 淡水大型底栖无脊椎动物环境 DNA监测应客观、科学地反映监测对象的实际状况，符合生物学、生 态学和环境科学的基本原理和要求。 4.1