ICS65.120 CCSB46 中华人民共和国国家标准 GB/T45643—2025 饲料中异噻唑啉酮类化合物的测定 液相色谱-串联质谱法 Determinationofisothiazolinonecompoundsinfeeds—Liquid chromatography-tandemmassspectrometry 2025-05-30发布 2025-12-01实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会发布前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)提出并归口。 本文件起草单位:上海市动物疫病预防控制中心、中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究 所、中国农业科学院饲料研究所。 本文件主要起草人:黄士新、张婧、吴雨珊、严凤、曹莹、吴剑平、樊霞、马莹、李俊、谷旭、商军、 索德成、黄家莺、潘娟、张浩然、徐汀、王博、贾铭。 ⅠGB/T45643—2025 饲料中异噻唑啉酮类化合物的测定 液相色谱-串联质谱法 1 范围 本文件描述了饲料中3种异噻唑啉酮类化合物的液相色谱-串联质谱测定方法。 本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料、添加剂预混合饲料及混合型饲料添加剂中甲基异 噻唑啉酮(MIT)、甲基氯异噻唑啉酮(CIT)、噻霉酮(BIT)的测定。 本文件检出限为10μg/kg,定量限为30μg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T20195 动物饲料 试样的制备 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 试样中的待测物用乙腈提取,经通过式亲水亲脂平衡固相萃取柱净化,用液相色谱-串联质谱仪检 测,基质匹配标准曲线校准,外标法定量。 5 试剂或材料 除非另有规定,仅使用分析纯试剂。 5.1 水:GB/T6682,一级。 5.2 甲醇:色谱纯。 5.3 乙腈。 5.4 标准储备溶液(1mg/mL):准确称取标准品MIT(CAS号:2682-20-4,纯度不低于99%)、CIT (CAS号:26172-55-4,纯度不低于99%)、BIT(CAS号:2634-33-5,纯度不低于99%)适量(精确至 0.01mg),分别用甲醇(5.2)溶解、定容、混匀,配制成1mg/mL的标准储备溶液,或购买市售有证标准 溶液。于-18℃以下保存,有效期为6个月。 5.5 混合标准中间溶液(10μg/mL):分别准确移取标准储备溶液(5.4)各100μL于10mL容量瓶 中,用甲醇(5.2)稀释、定容,混匀。于2℃~8℃保存,有效期为3个月。 5.6 混合标准系列溶液:准确移取适量混合标准中间溶液(5.5)于容量瓶中,分别用水稀释配制成质量 1GB/T45643—2025 浓度分别为2.5ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、200ng/mL、500ng/mL的混合标准系列溶 液。临用现配。 5.7 微孔滤膜:0.22μm,有机系。 5.8 通过式亲水亲脂平衡固相萃取柱:60mg/3mL,或性能相当者。 6 仪器设备 6.1 液相色谱-串联质谱仪:配电喷雾离子源。 6.2 分析天平:精度0.01mg和0.01g。 6.3 振荡器:转速不低于1500r/min。 6.4 离心机:转速不低于4000r/min。 6.5 涡旋混合器。 7 样品 按GB/T20195的规定制备样品,至少200g,粉碎使其全部通过0.425mm孔径的试验筛,充分混 匀,装入密闭容器中,备用。选取类型相同、均匀一致,且在待测物保留时间处的仪器响应值小于方法定 量限30%的饲料样品,作为空白样品。 8 试验步骤 8.1 提取 平行做两份试验。称取试样2g(精确至0.01g)于50mL离心管中,准确加入10mL乙腈(5.3),涡 旋混匀1min,振荡提取10min,4000r/min离心5min,移取上清液于另一离心管中。重复提取一 次,合并上清液,混匀,备用。 8.2 净化 移取2mL备用液(8.1)过固相萃取柱(5.8),收集滤出液于10mL离心管中,充分混匀。准确移取 0.5mL滤出液,加水定容至2mL,涡旋混匀,微孔滤膜(5.7)过滤,待测。 8.3 基质匹配标准系列溶液的制备 称取空白试样,按照8.1和8.2处理得到空白基质溶液,准确移取混合标准系列溶液(5.6)各 100μL,用空白基质溶液定容至1mL,涡旋混合30s,配制成质量浓度分别为0.25ng/mL、0.5ng/mL、 2ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、50ng/mL的基质匹配标准系列溶液,待测。 8.4 测定 8.4.1 液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下: a) 色谱柱:C18柱,长100mm,内径3.0mm,粒径1.8μm,或性能相当者; b) 流动相:A相为水(5.1),B相为甲醇(5.2),梯度洗脱程序见表1; c) 流速:0.3mL/min; d) 柱温:30℃; 2GB/T45643—2025 e) 进样量:5μL。 表1 梯度洗脱程序 时间 minA %B % 0.00 70 30 6.50 10 90 7.40 10 90 7.50 70 30 11.00 70 30 8.4.2 质谱参考条件 质谱参考条件如下: a) 离子源模式:电喷雾电离源; b) 扫描方式:正离子; c) 监测方式:多反应监测(MRM); d) 电离电压:4.0kV; e) 源温度:350℃; f) 鞘气:4.6L/min; g) 反吹气:1L/min; h) 辅助气:8L/min; i) 雾化器温度:350℃。 MRM离子对、锥孔电压及碰撞能量见表2。 表2 异噻唑啉酮类化合物MRM离子对、锥孔电压及碰撞能量参考值 被测物名称监测离子对 m/z锥孔电压 V碰撞能量 eV MIT116.1>71.0 116.1>101.1a5821 24 CIT150.2>87.0a 150.2>115.010937 20 BIT152.0>105.0 152.0>109.0a8723 22 a定量离子。 8.4.3 基质匹配标准系列溶液和试样溶液测定 在仪器的最佳条件下,分别取基质匹配标准系列溶液(8.3)和试样溶液(8.2)上机测定。基质匹配 标准溶液的定量离子对色谱图见附录A。 3GB/T45643—2025 8.4.4 定性 在相同试验条件下,试样溶液与基质匹配标准系列溶液(质量浓度相当)中待测物的保留时间一 致,其相对偏差在±2.5%之内。根据表2选择的定性离子对,比较试样谱图中待测物定性离子对的相 对离子丰度与质量浓度接近的基质匹配标准系列溶液中对应的定性离子对的相对离子丰度,若偏差不 超过表3规定的范围,则可判定为试样中存在对应的待测物。 表3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 % 相对离子丰度 >50 >20~50 >10~20 ≤10 最大允许偏差 ±20 ±25 ±30 ±50 8.4.5 定量 以基质匹配标准溶液中待测物质量浓度为横坐标,定量离子对色谱峰面积为纵坐标,绘制标准曲 线,其相关系数应不低于0.99。试样溶液与基质匹配标准溶液中待测物的响应值均应在仪器检测的线 性范围内。如超出线性范围,应用空白基质溶液稀释后重新测定。单点校准定量时,试样溶液中待测物 质量浓度与基质匹配标准溶液质量浓度相差不超过30%。 9 试验数据处理 试样中待测物的含量以质量分数wi计,数值以微克每千克(μg/kg)表示。多点校准按公式(1)计 算;单点校准按公式(2)计算。 wi=ρi×V1×V3×1000 V2×m×1000×f ……………………(1) 式中: ρi ———由基质匹配标准曲线得到的试样溶液中待测物的质量浓度,单位为纳克每毫升 (ng/mL); V1———提取溶液总体积,单位为毫升(mL); V3———最终定容体积,单位为毫升(mL); 1000———换算系数; V2———移取的滤出液体积,单位为毫升(mL); m———试样质量,单位为克(g); f———超出线性范围后试样溶液的稀释倍数。 wi=Ai×ρsi×V1×V3×1000 Asi×V2×m×1000×f ……………………(2) 式中: Ai ———试样溶液中待测物的峰面积; ρsi———基质匹配标准溶液中待测物的质量浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL); V1———提取溶液总体积,单位为毫升(mL); V3———最终定容体积,单位为毫升(mL); 1000———换算系数; Asi———基质匹配标准溶液中待测物的峰面积; 4GB/T45643—2025