饲料中氯苯那敏和溴苯那敏的测定 液相色谱﹘串联质谱法 Determination of chlorphenamine and bromphenamine in feeds— Liquid chromatography﹘tandem mass spectrometry  ICS  65.120 CCS  B 46   中华人民共和国国家标准 GB/T 44740—2024 2024-10-2 6发布 2025-05-0 1实施     国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会 发 布前　　言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC 76）提出并归口。 本文件起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所。 本文件主要起草人：索德成、樊 霞、管鑫、冯玉超、肖志明、王克然、鲁利萍、伍宏凯、张航俊、 唐建。   GB/T 44740—2024     Ⅰ 饲料中氯苯那敏和溴苯那敏的测定 液相色谱﹘串联质谱法 1　范围   本文件描述了饲料中氯苯那敏和溴苯那敏的液相色谱﹘串联质谱法测定方法。 本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料、添加剂预混合饲料和混合型饲料添加剂中氯苯那 敏和溴苯那敏的测定。 本文件的检出限为0.003 mg/kg、定量限为0.01 mg/kg。 2　规范性引用文件   下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用 于本文件。 GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 20195　动物饲料　试样的制备 3　术语和定义   本文件没有需要界定的术语和定义。 4　原理   试样中待测物用甲酸﹘乙腈溶液提取，经混合型强阳离子交换固相萃取小柱净化，液相色谱﹘串联质 谱仪测定，基质匹配标准曲线校准，外标法定量。 5　试剂或材料   除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 5.1　水：GB/T 6682，一级。 5.2　甲酸：色谱纯。 5.3　甲醇：色谱纯。 5.4　乙腈：色谱纯。 5.5　0.1% 甲酸溶液：移取1 mL甲酸（5.2），用水稀释至1 000 mL，混匀。 5.6　1%甲酸﹘乙腈溶液：移取1 mL甲酸，用乙腈稀释至100 mL，混匀。 5.7　5%氨水﹘甲醇溶液：取氨水5 mL，加甲醇稀释至100 mL，混匀。 5.8　氯苯那敏标准储备溶液（500 μg/mL）：称取氯苯那敏（CAS号：132﹘22﹘9，纯度≥98%） 25 mg，精确至0.01 mg，用乙腈溶解，转移至50 mL容量瓶中定容，摇匀。－18ºC以下贮存，有效期不 超过6个月，或采用标准物质/标准样品。 5.9　溴苯那敏标准储备溶液（500 μg/mL）：称取溴苯那敏（CAS号：86﹘22﹘6，纯度≥98%） GB/T 44740—2024     1 25 mg，精确至0.01 mg，用乙腈溶解，转移至50 mL容量瓶中定容，摇匀。－18 ℃以下贮存，有效期不 超过6个月，或采用标准物质/标准样品。 5.10　混合标准中间溶液（50 μg/mL）：分别准确移取氯苯那敏标准储备溶液（5.8）和溴苯那敏标准 储备溶液（5.9）1 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释并定容，混匀。－18 ℃以下贮存，有效期不超 过1个月。 5.11　标准系列工作溶液：准确移取适量的混合标准中间溶液（5.10），用0.1%甲酸溶液（5.5）配制 成质量浓度分别为1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL的标准工作溶 液，混匀。临用现配。 5.12　混合型阳离子交换固相萃取小柱：以苯磺酸化的聚苯乙烯﹘二乙烯基苯高聚物为填料， 60 mg/3 mL，或性能相当者。 5.13　微孔滤膜：0.22 μm，有机系。 6　仪器设备   6.1　液相色谱﹘串联质谱仪：配电喷雾离子源。 6.2　分析天平：精度分别为 0.1 mg和0.01 mg。 6.3　离心机：转速不低于8 000 r/min。 6.4　超声波清洗仪。 6.5　固相萃取装置。 6.6　氮吹仪。 7　样品   按照 GB/T 20195规定制备试样，至少200 g配合饲料、浓缩饲料和精料补充料粉碎使其全部过 0.425 mm试验筛，充分均匀；添加剂预混合饲料和混合型饲料添加剂无须粉碎，混合均匀，装入密闭容 器中，备用。选取类型相同、均匀一致，且在待测物保留时间处，其仪器响应值小于方法定量限相应值 30%的饲料样品，作为空白试样。 8　试验步骤  8.1　提取   平行做2份试验。称取配合饲料、浓缩饲料、精料补充料5 g，添加剂预混合饲料和混合型饲料添加 剂1 g，精确至0.1 mg，置于50 mL离心管中，加入20 mL1%甲酸﹘乙腈溶液（5.6），超声提取 30 min，每10 min振摇1次，8 000 r/min离心5 min，取上清液，备用。 8.2　净化   混合型阳离子交换固相萃取小柱（5.12）依次用3 mL甲醇、3 mL水活化，准确移取10 mL备用液 过柱。用3 mL水和3 mL甲醇淋洗混合型阳离子交换柱，抽干。用3 mL5%氨水﹘甲醇溶液（5.7）洗 脱，收集洗脱液于40 ℃水浴氮气吹至近干，准确加入1 mL0.1%甲酸溶液（5.5）复溶，涡旋混匀，过 微孔滤膜（5.13），上机。 8.3　基质匹配标准系列溶液的制备   选取空白试样，按8.1和8.2 步骤处理，在净化、吹干后的残渣中，分别准确添加1 mL混合标准溶 GB/T 44740—2024     2 液，配制成质量浓度分别为1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL的基 质匹配标准系列溶液。过微孔滤膜（5.13），上机。 8.4　液相色谱参考条件  8.4.1　液相色谱参考条件   液相色谱参考条件如下： 色谱柱：C18色谱柱，柱长100 mm，内径2.1 mm，粒径1.7 μm，或性能相当者； a） 流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱，洗脱程序见表1； b） 流速：0.4 mL/min； c） 柱温：30 ℃； d） 进样量：5 µL。 e） 表1　梯度洗脱程序   时间/min 流速/（mL/min） A/% B/% 0 0.4 80 20 0.5 0.4 80 20 2 0.4 40 60 2.5 0.4 30 70 3.0 0.4 5 95 4.5 0.4 5 95 5.5 0.4 70 30 6.1 0.4 80 20 7.0 0.4 80 20 8.4.2　质谱参考条件   质谱参考条件如下： 电离方式：电喷雾电离，正离子模式（ESI+）； a） 检测方式：多反应监测（MRM）； b） 毛细管电压：3.0 kV； c） 离子源温度：250 ℃； d） 脱溶剂温度：320 ℃； e） 雾化气、干燥气为高纯氮气，碰撞气为高纯氩气或其他合适气体； f） 喷雾电压、碰撞能量等参数应优化至最优灵敏度； g） 监测离子对、解离电压和碰撞能量见表2。 h） 表2　氯苯那敏和溴苯那敏的定性离子对、定量离子对、解离电压和碰撞能量参考值   化合物 离子对(m/z) 解离电压 /V 碰撞能量 /eV 氯苯那敏 275.2>167.2 5044 275.2>230.2 ａ 45 GB/T 44740—2024     3 表2　氯苯那敏和溴苯那敏的定性离子对、定量离子对、解离电压和碰撞能量参考值（续）  化合物 离子对(m/z) 解离电压 /V 碰撞能量 /eV 溴苯那敏 319.1>167.1 ａ 5044 319.1>274 55  　　 a  定量离子 。 8.4.3　基质匹配标准系列溶液和试样溶液测定   在仪器的最佳条件下，分别取基质匹配标准系列溶液（8.3）和试样溶液（8.2）上机测定。庆大霉 素标准溶液的定量离子色谱图见附录A。 8.4.4　定性   在相同试验条件下，试样溶液中待测物的保留时间应与标准系列溶液（浓度相当）中待测物的保留 时间一致，其相对偏差在±2.5%之内。根据表2选择定性离子对，比较试样色谱图中待测物监测离子对 的相对离子丰度与浓度接近的标准系列溶液中对应的监测离子对的相对离子丰度，若偏差不超过表3规 定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。 表3　定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差   相对离子丰度 >50% >20%~50% >10%~20% ≤10% 最大允许偏差 ±20% ±25% ±30% ±50% 8.4.5　定量   以基质匹配标准系列溶液中各待测物的质量浓度为横坐标、色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线， 标准曲线的相关系数应不低于0.99。试样溶液与标准溶液中待测物的响应值均应在仪器检测的线性范围 内，如超出线性范围，应重新测定。单点校准定量时，试样溶液中待测组分质量浓度与标准溶液质量浓 度相差不超过30%。 9　试验数据处理   试样中待测物含量以质量分数wi计，数值以毫克每千克（mg/kg）表示。多点校准按式（1）计 算，单点校准按式（2）计算。 wi=iV1V3 V2m1 000…………………………（ 1） 式中： ρi ─ 由标准曲线得到的试样溶液中待测物质量浓度，单位为纳克每毫升