ICS65.020.99 CCSB30 中华人民共和国国家标准 GB/T44734—2024 食用菌中凝集素的测定 高效液相色谱法 Methodforthedeterminationoflectininfungi— Highperformanceliquidchromatography 2024-10-26发布 2024-10-26实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会发布前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国标准化研究院提出并归口。 本文件起草单位:中国科学院过程工程研究所、丽江中源绿色食品有限公司、深圳市先进质量管理 技术研究院、云南云科特色植物提取实验室有限公司、日照市质量检验检测研究院、河北中科汉禧生物 科技有限公司、陕西康美达生物科技有限公司、中国标准化研究院、天圣制药集团重庆药物研究院有限 公司、北京化工大学、中国农业大学、中科久伴(西安)生物科技有限公司、天津知了科技有限公司、谱尼 测试集团股份有限公司、莱阳市检验检测中心、通标标准技术服务(青岛)有限公司、中山市食品学会、食 药环检验研究院(山东)集团有限公司、利和味道(青岛)食品产业股份有限公司。 本文件主要起草人:孔英俊、张贵锋、詹松坤、康跻耀、王朋、刘名概、彭宗林、马骁、李旭光、欧阳静、 刘爽、邬吉野、姚志轶、刘昕昊、刘璐、贺佩、席兴军、兰韬、魏芸、刘聪、刘媛媛、邱继权、史珅、何琰、 谭鹏刚、姚亚伟、富玉、张延杰、潘刚、张卫星、刘晓梅、孙学文、王剑、孙绍力。 ⅠGB/T44734—2024 食用菌中凝集素的测定 高效液相色谱法 1 范围 本方法描述了食用菌中凝集素含量的高效液相测定方法。 本文件适用于金针菇、平菇、白玉菇、香菇、杏鲍菇中凝集素的测定,其他种类食用菌参考。 本文件方法凝集素的检出限鲜品为6.2mg/kg,干品为9.2mg/kg;定量限鲜品为12.4mg/kg,干 品为18.4mg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 试样中凝集素经磷酸盐缓冲液提取,利用溶解度、分子质量差异,通过硫酸铵沉淀、超滤浓缩后,高 效液相色谱法测定,以保留时间定性,外标法定量。 5 试剂和材料 除非另有规定,仅使用分析纯试剂。 5.1 水,GB/T6682,一级。 5.2 乙腈(C2H3N):色谱纯。 5.3 三氟乙酸(C2HO2F3)。 5.4 硫酸铵[(NH4)2SO4]。 5.5 磷酸氢二钠溶液(0.02mol/L):1L一级水中加入7.16g十二水合磷酸氢二钠(NaHPO4· 12H2O)。 5.6 磷酸二氢钠溶液(0.02mol/L):1L一级水中加入3.12g二水合磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)。 5.7 磷酸盐提取液(0.02mol/L):磷酸氢二钠溶液和磷酸二氢钠溶液混合,调节pH至7.2。 5.8 硫酸铵溶液(30%饱和度):称取176g硫酸铵[(NH4)2SO4]固体溶于一级水中,定容至1L。 5.9 水系滤膜:孔径0.45μm,用于过滤流动相。 5.10 食用菌中凝集素(电泳纯度≥95%),或经相关部门认证的标准品或标准样品。 1GB/T44734—2024 5.11 食用菌中凝集素标准溶液:准确称取10mg食用菌中凝集素,于试管中用水溶解,并转移至 10mL容量瓶中定容至刻度线。该标准溶液中食用菌中凝集素的质量浓度为1mg/mL,-20℃冰箱 避光保存,有效期一周。 6 仪器和设备 6.1 高效液相色谱仪:配紫外或二极管阵列检测器。 6.2 超声波振荡器。 6.3 天平:感量0.01g。 6.4 分析天平:感量0.0001g。 6.5 离心机:10000g。 6.6 超滤离心管:50mL,截留分子质量10kD。 6.7 凝胶色谱柱:7.8mmI.D.×30cm,分析球蛋白分子质量范围5kD~150kD。 6.8 针式微孔过滤器:0.22μm,直径13mm的聚四氟乙烯(PTFE)滤膜或者相当者。 7 试样制备 7.1 鲜样 食用菌鲜样用干净纱布擦去表面附着物,取50g,切碎之后精密称重,打浆直接检测或者放入密封 容器中,-20℃保存备用。 7.2 干样 取食用菌干样样品50g,用样品粉碎机粉碎,过425μm标准网筛,精密称重,直接检测或者将样品 装于密封容器中,-20℃保存备用。 8 凝集素提取 8.1 鲜样 取处理好的鲜样10g置于500mL烧杯中,加入300mL磷酸盐提取液(5.7)摇匀,超声30min,置 于4℃冰箱中提取4h。取出摇匀后8000g离心20min,用定性滤纸过滤,取滤液5mL放入离心管 中,加入5mL硫酸铵溶液(5.8),10000g离心10min,上清液用超滤离心管以8000g离心15min,补 加纯水,共超滤6次,上清液转入5mL容量瓶中,用水定容,过0.22μm的水系针式滤膜,以供高效液 相色谱检测使用。 8.2 干样 取处理好的干样10g置于500mL烧杯中,加入450mL磷酸盐提取液(5.7)摇匀,超声30min,置 于4℃冰箱中提取4h。取出摇匀后8000g离心20min,用定性滤纸过滤,取滤液5mL放入离心管 中,加入5mL硫酸铵溶液(5.8),10000g离心10min,上清液用超滤离心管以8000g离心15min,补 加纯水,共超滤6次,上清液转入5mL容量瓶中,用水定容,过0.22μm的水系针式滤膜,以供高效液 相色谱检测使用。 2GB/T44734—2024 9 测定 9.1 参考色谱条件 9.1.1 色谱柱:凝胶色谱柱,7.8mmI.D.×30cm,分析球蛋白分子质量范围5kD~150kD。 9.1.2 流动相:乙腈、水、三氟乙酸溶液,体积比为40∶60∶0.05。 9.1.3 流速:0.5mL/min。 9.1.4 紫外波长(UV):280nm。 9.1.5 进样量:100μL。 9.2 标准曲线 准确移取0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.5mL、1.0mL食用菌中凝集素标准溶液(5.11)于不同的 5mL容量瓶中,用水稀释、定容至刻度线,摇匀,得到食用菌中凝集素系列标准工作溶液,质量浓度分 别为20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、100μg/mL、200μg/mL,按参考色谱条件测定,食用菌中凝集素 典型高效液相色谱图见附录A中图A.1,以食用菌中凝集素质量浓度为横坐标、相应的峰面积为纵坐 标,绘制标准曲线或计算线性回归方程。 9.3 测定 样品典型高效液相色谱图见图A.2,按照保留时间进行定性,样品与标准品保留时间的相对偏差不 大于10%,多点校正外标法定量。待测样液中凝集素的响应值应在标准曲线范围内,超过线性范围则 应稀释后再进样分析。同时做空白试验。 10 结果计算与表示 10.1 结果计算 试样中凝集素的量以质量分数w计,单位以毫克每千克(mg/kg)表示,鲜样凝集素按式(1)计算。 w=A×(1+30)×10-6…………………………(1) 式中: w———供试品中凝集素总含量,单位为毫克每千克(mg/kg); A———根据供试品的峰面积计算出的凝集素质量浓度,单位为微克每毫升(μg/mL); 30———加入的提取液倍数。 干样凝集素按式(2)计算。 w=A×(1+45)×10-6…………………………(2) 式中: w———供试品中凝集素总含量,单位为毫克每千克(mg/kg); A———根据供试品的峰面积计算出的凝集素质量浓度,单位为微克每毫升(μg/mL); 45———加入的提取液倍数。 10.2 结果表示 测定结果以两次平行测定值的算术平均值表示,计算结果保留两位有效数字。 3GB/T44734—2024 11 精密度 11.1 重复性 在重复性条件下获得的两次独立测试结果的差值不大于这两个测定值的算术平均值的5%。 11.2 再现性 再现性条件下获得的两次独立性测试结果的差值不大于这两个测定值的算术平均值的10%。 4GB/T44734—2024