ICS13.300;11.100 CCSA80 中华人民共和国国家标准 GB/T43450—2023 化学品 急性眼刺激体外细胞试验 TRPV1活性检测法 Chemicals—Invitrocellularassayforacuteeyeirritation— TRPV1activitydetectionmethod 2023-11-27发布 2024-06-01实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会发布前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口。 本文件起草单位:南京市产品质量监督检验院(南京市质量发展与先进技术应用研究院)、中国药科 大学、中国化工经济技术发展中心、中检科健(天津)检验检测有限责任公司、厦门丰力扬科技有限公司、 浙江辉日环境检测有限公司。 本文件主要起草人:张驰、强雨薇、曹征宇、李敏、赵芳、杨淼、乔玲、吴肖肖、王灿、纪晗旭、梅秀明、 王浩杰、步江涛、徐婧婧、蒋迪尧、李雨枫、刘春艳、王雷、霍健、李振益、王燕。 ⅠGB/T43450—2023 化学品 急性眼刺激体外细胞试验 TRPV1活性检测法 1 范围 本文件规定了化学品急性眼刺激试验的方法原理、仪器与试剂耗材、试验和结果判定。 本文件适用于化学品急性眼刺激性的体外检测,化学品溶于水且受试溶液的pH应在6.5~7.8范 围内。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T21609 化学品 急性眼刺激性/腐蚀性试验方法 SN/T2285 化妆品体外替代试验实验室规范 SN/T3899 化妆品体外替代试验 良好细胞培养和样品制备规范 3 术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 眼刺激性 eyeirritation 眼球表面接触受试物后产生的眼睛可逆性炎性变化。 [来源:GB/T21609,3.1] 3.1.2 激动剂 agonist 既有亲和力又有内在活性,能与受体结合并激动受体产生效应的化合物。 3.1.3 拮抗剂 antagonist 与受体结合后本身不引起生物学效应,但能阻断该受体产生激动效应的化合物。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AUC:曲线下面积(AreaUnderCurve) BSA:牛血清白蛋白(BovineSerumAlbumin) DMEM:杜氏改良依格尔培养基(Dulbecco’sModifiedEagleMedium) 1GB/T43450—2023 DMSO:二甲基亚砜(DimethylSulfoxide) EDTA:乙二胺四乙酸(EthylenedinitrilotetraaceticAcid) FBS:胎牛血清(FetalBovineSerum) HBSS:Hank’s平衡盐溶液(Hank’sBalancedSaltSolution) HEPES:4-羟乙基哌嗪乙磺酸[4-(2-Hydroxyethyl)-1-PiperazineethanesulfonicAcid] PBS:磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferedSaline) TRPV1:瞬时受体电位香草酸亚型1基因(TransientReceptorPotentialVanilloidType-1) TRPV1-HEK293:稳定转染人源TRPV1的人胚胎肾293细胞系(HumanTransientReceptorPo- tentialVanilloidType-1StableTransfectedHEK293CellLine) 4 方法原理 具有眼刺激性的化学品可通过激活TRPV1通道引起钙离子内流,使细胞内钙离子浓度迅速升高。 通过测试化学品作用于TRPV1-HEK293细胞后的胞内钙离子浓度的改变,反映TRPV1通道的实时 变化,从而定性检测化学品的急性眼刺激性。 5 仪器与试剂耗材 5.1 仪器 5.1.1 Ⅱ级生物安全柜或超净工作台。 5.1.2 二氧化碳培养箱:温度为37℃±1℃,二氧化碳体积分数为5%±1%,相对湿度为90%±5%。 5.1.3 恒温水浴箱:温度为37℃±1℃。 5.1.4 倒置显微镜。 5.1.5 高通量实时荧光检测分析仪。 5.1.6 电子天平:最小分度值为0.1mg。 5.1.7 细胞计数仪或血球计数器。 5.1.8 离心机。 5.1.9 混悬仪。 5.1.10 液氮罐。 5.1.11 多道可调微量移液器:30μL~300μL或20μL~200μL,最大允许系统误差为5%。 5.1.12 超低温冰箱。 5.2 试剂耗材 5.2.1 水:实验用水符合GB/T6682一级用水的要求。 5.2.2 TRPV1-HEK293细胞系。 5.2.3 DMEM培养基:DMEM培养基可选用各种商品供应的粉末培养基按生产厂商提供资料配制,并 用0.22μm的滤膜过滤除菌,储存于4℃不超过1个月。 5.2.4 完全培养基:常规培养时,完全培养基配方为90%DMEM、10%FBS、100U/mL青霉素、 100μg/mL链霉素、1mg/mL遗传霉素(CAS:108321-42-2)。试验时,完全培养基配方为90% DMEM、10%FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素。 5.2.5 PBS:称取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4、0.24gKH2PO4,溶于900mL双蒸水,调节 pH至7.2,用双蒸水定容至1000mL,115℃高压灭菌15min,储存于4℃不超过1个月。 5.2.6 0.05%胰蛋白酶-0.02%EDTA:称取0.05g胰蛋白酶干粉和0.02gEDTA,先加入少量PBS溶 2GB/T43450—2023 液,4℃低速搅拌,完全溶解后调节pH至7.2,用PBS溶液定容至100mL,过滤除菌,储存于-20℃,使用 前于37℃预热。 5.2.7 Hank’s平衡盐溶液:称取8.0gNaCl、0.4gKCl、0.1gMgSO4·7H2O、0.1gMgCl2·6H2O、 0.06gNa2HPO4·2H2O、0.06gKH2PO4、1.0g葡萄糖、0.14gCaCl2、0.35gNaHCO3,加700mL双 蒸水充分混匀,调pH至7.2,用双蒸水定容至1000mL,储存于4℃不超过1个月。 5.2.8 HBSS缓冲液:称取HEPES(CAS:7365-45-9)2.383g,加入Hank’s平衡盐溶液定容至 500mL,4℃保存备用。 5.2.9 辣椒素(Capsaicin)溶液:TRPV1激动剂(CAS:404-86-4)。称取1mg辣椒素溶于3.274mL DMSO中,配制成1mmol/L的母液,-20℃分装保存。使用前取3μL母液,加372μLHBSS缓冲 液,即用即配。 5.2.10 辣椒平(Capsazepine)溶液:TRPV1拮抗剂(CAS:138977-28-3)。称取5mg辣椒平溶于 0.132mLDMSO中,配制成100mmol/L的母液,-20℃分装保存。使用前取10μL母液,加10mL HBSS缓冲液,即用即配。 5.2.11 钙离子染料Fluo-4AM溶液:称取1mgFluo-4AM(CAS:273221-67-3),溶于227.9μL DMSO中,配制成4mmol/L的母液,避光保存于-20℃,分装保存。使用前取10μLFluo-4AM母 液,加9mLHBSS缓冲液和1mL50mg/mLBSA(CAS:9048-46-8,HBSS缓冲液配制),37℃预热,即 用即配。 5.2.12 0.22μm滤器。 5.2.13 无菌吸管:规格10mL。 5.2.14 细胞培养瓶:25cm2、75cm2。 5.2.15 细胞冻存管。 5.2.16 96孔黑色透明平底酶标板(细胞板)。 5.2.17 96孔尖底透明酶标板(加样板)。 6 试验方法 6.1 基本要求 细胞培养相关的溶液和器皿等均应无菌,并且所有操作都应在无菌环境和II级生物安全柜或超净 工作台中进行。定期检查细胞,确保无微生物污染。细胞由有资质的细胞库提供。细胞培养、传代、冻 存应符合SN/T3899的要求,使用25代之内的细胞进行试验。试验过程应符合SN/T2285的要求。 6.2 试验步骤 6.2.1 细胞培养 日常培养时,TRPV1-HEK293细胞使用常规培养的完全培养基在37℃±1℃,二氧化碳体积分数 为5%±1%,相对湿度为90%±5%条件下培养。 6.2.2 细胞接种 当细胞进行了2次~3次传代,显微镜下观察生长状况良好,培养液清澈透明无杂质,细胞无悬浮 或微量悬浮,贴壁均匀,胞浆内颗粒少,则可进行细胞接种。使用PBS溶液洗涤细胞3次~4次,加入预 热至37℃的0.05%胰蛋白酶(含EDTA)溶液消化细胞,用完全培养基调整细胞浓度以2×104个/孔接 种至细胞板的所有细胞孔,每孔150μL。空白对照孔中不加液体。在细胞培养板的外周孔中加入 200μL无菌双蒸水,以减少培养基的蒸发(细胞板分布见图1)。将细胞板置于二氧化碳培养箱中培养 3GB/T43450—2023 过夜。次日,如细胞融合达到培养瓶底壁的85%~90%且形态正常,可进行下一