SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4178—2015 南瓜花叶病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Squash mosaic virus 行业标准信息服务平台 2015-02-09发布 2015-09-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4178—2015 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布结构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出人境检验检疫 局、中华人民共和国北京出人境检验检疫局、武汉哇哇噻纳技术开发有限公司。 本标准主要起草人：廖富荣、黄迎波、林石明、梁新苗、吴媛、陈青、邓丛良、赵晓丽、聂棱、陈红运。 行业标准信息服务平台 1 SN/T4178—2015 南瓜花叶病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了南瓜花叶病毒血清学、分子生物学的检测和鉴定方法。 本标准适用于植物上南瓜花叶病毒的检测与鉴定。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T1809进出境植物种子检疫规程 SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3南瓜花叶病毒基本信息 中文名称：南瓜花叶病毒 英文名称：Squashmosaicvirus 缩写：SqMV 分类地位：小RNA病毒目（Picornavirales）、伴生豇豆病毒科（Secoviridae）、豇豆花叶病毒亚科 （Comovirinae）、豇豆花叶病毒属（Comovirus）成员。 传播方式：种子传播、昆虫介体传播和机械传播。 SqMV的其他信息参见附录A。 4 方法原理 南瓜花叶病毒血清学、分子生物学特征是制定本标准的主要依据。 信息服 5 仪器设备与试剂 5.1 主要仪器设备与用具 本标准主要涉及到的仪器设备和用具为：植物汁液提取仪、研磨仪、酶标仪、洗板机、微量天平（感 pH计、各种量程的可调移液器（1000μL、200μL、100μL、20μL、10μL、2μL)。 5.2 2主要试剂与配制 血清学试剂及其缓冲液配制见附录B,分子生物学试剂及其缓冲液配制见附录C和附录D。 1 SN/T4178—2015 6检测与鉴定 6.1抽样检查 按照SN/T2122、SN/T1809给出的方法进行抽样、取样。 6.2隔离种植 对于种子样品，一方面，可用种子直接检测（如取6g的种子，研磨粉碎后检测）；另一方面，可先隔 离种植后用苗进行检测。 隔离种植：在温室或植物生长箱等隔离条件下播种，至2片～3片叶后观察。对于疑似病毒症状的 植株，用以下方法（如DAS-ELISA、RT-PCR等）进行检测；对于未表现症状的植株，取约10株为一混合 样品，用DAS-ELISA方法检测。 6.3血清学检测 6.3.1DAS-ELISA检测 按附录B给出的方法，进行DAS-ELISA检测。用已知病毒分离物作阳性对照，健康植物组织作阴 性对照，样品提取缓冲液作空白对照。 6.3.2免疫层析检测 按试剂操作说明，进行免疫层析检测。 6.4分子生物学检测 6.4.1RT-PCR检测 按附录C给出的方法，进行RT-PCR检测。用已知病毒分离物作阳性对照，健康植物组织作阴性 对照，并设置空白对照 6.4.2 IC-RT-PCR 检测 按附录D给出的方法，进行IC-RT-PCR检测。用已知病毒分离物作阳性对照，健康植物组织作阴 性对照，并设置空白对照。 6.4.3序列测定与分析 RT-PCR或IC-RT-PCR检测阳性的样品，可进一步进行序列测定分析。把测定的序列与已知序列 进行比对，以确定是否为SqMV序列。 注：根据国际病毒分类委员会（ICTV)第九次分类报告中伴生豇豆病毒科（Secoviridae)病毒种类的分类标准，其中 关于基因组序列的判定依据为：CP的氨基酸序列一致性小于75% 7结果判定 阳性时，则判定为检出SqMV。 7.2当分子生物学检测(RT-PCR或IC-RT-PCR)结果均为阳性、测定的序列为SqMV序列时，则判定 2