SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2518—2010 贝类食品中食源性病毒检测方法 纳米磁珠-基因芯片法 Determination of food borne viruses in shellfish- MNP-gene chip method 行业标准信息服务平台 2010-03-02发布 2010-09-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T2518—2010 前言 本标准的附录A为规范性附录，附录B和附录C为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 工程研究中心、北京金纳信生物有限公司、天津生物芯片有限公司。 本标准的主要起草人：曾静、周琦、魏海燕、陈广全、饶红、张西萌、藏庆伟、李燕鹏、张亮、汪琦、 曹勃阳、聂棱、王敏。 本标准系首次发布出入境检验检疫行业标准。 行业标准信息服务平台 I SN/T 2518—2010 贝类食品中食源性病毒检测方法 纳米磁珠-基因芯片法 1范围 本标准规定了贝类中甲肝病毒、GI型和GⅡ型诺如病毒、A群轮状病毒和星状病毒的纳米磁珠 基因芯片检测方法。 本标准适用于贝类中甲肝病毒、GI型和GⅡ型诺如病毒、A群轮状病毒和星状病毒的检测：食物 中毒样品中上述5种病毒的检测可参照使用。 2规范性引用文件 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 SN/T1193基因检验实验室技术要求 3术语、定义和缩略语 下列术语、定义和缩略语适用于本标准。 3.1术语和定义 3.1. 1 基因芯片gene chip 生物芯片技术是通过缩微技术，根据分子间特异性地相互作用原理，将生命科学领域中不连续的分 析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统，以实现对基因及其他生物组分的准确、 快速、大信息量的检测 3.1.2 甲肝病毒hepatitisAvirus 甲肝病毒属中只有人甲型肝炎病毒一个成员，简称甲肝病毒。甲肝病毒粒子的直径约27nm， 32个壳粒构成衣壳，呈球形，二十面体立体对称，无包膜；甲肝病毒的基因组为单股正链RNA，3端带 有polyA尾。 3. 1. 3 诺如病毒 norovirus 诺如病毒属于人类杯状病毒科，是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。诺如病毒直径约为 26nm35nm，无包膜，表面粗糙，球形，呈二十面体对称，诺如病毒基因组是单股正链RNA，3端具有 polyA尾。诺如病毒共可分为5个型，其中感染人的主要是GI型和GI型。 3. 1. 4 轮状病毒rotavirus 轮状病毒属于呼肠弧病毒科（Reoviridae）、轮状病毒属。病毒颗粒呈球形，直径60nm～80nm，双 SN/T 2518—2010 层衣壳，无包膜，负染后在电镜下观察，病毒外形呈车轮状，故名轮状病毒。 3. 1.5 星状病毒 astrovirus 属于星状病毒科，星状病毒属。病毒颗粒呈球形，无包膜，直径为28nm～30nm。病毒基因组为单 股正链RNA，长6.8kb，3端有polyA尾。 3.2缩略语 3. 2. 1 bp base pair 碱基对。 3.2.2 DEPCdiethyl pyrocarbonate 焦碳酸乙二酯。 3.2. 3 MNP magnetic nanoparticles 纳米磁珠。 3.2. 4 PEG polyethylene glycol 聚乙二醇。 3.2.5 RNase ribonuclease 核糖核酸酶或RNA酶。 4方法提要 贝类样品经前处理后，用纳米磁珠和传统方法提取病毒RNA，将病毒RNA逆转录成cDNA。以 cDNA为模板、用特异性引物进行PCR反应。PCR扩增产物与固定有5种病毒特异性探针的基因芯片 进行杂交，用芯片扫描仪对杂交芯片进行扫描并判定结果。本方法利用了基因芯片高通量的特点，同时 检测5种食源性致病病毒。 5试剂 所有实验用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNase容器分装；除另有说明，实验用水为 GB/T6682中一级水标准。 5.1阳性对照：病毒阳性样本，或选用含目的基因的质粒作为探针杂交的阳性对照。 5.2匀浆缓冲液1:见附录A.1.1。 5.3匀浆缓冲液2:见附录A.1.2。 5.4PEG8000溶液：见附录A.1.3。 5.5DEPC水：见附录A.1.4。 5.6引物和探针：5种病毒基因芯片检测所用引物核酸序列见表1，探针核酸序列见表2；根据表1的 核酸序列合成引物，用TAMRA标记的引物加DEPC水配制成40umol/L的浓度，未进行标记的引物 加DEPC水配制成5μmol/L的浓度，一20℃保存，备用。 表15种病毒RT-PCR引物名称和序列 病毒名称 引物(5"-3') 产物大小/bp HAV-F TGTGCTATGGTTCCTGGTGA 甲肝病毒 510 HAV-R CCCAATCGAATCTGAAGCAT 2