ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T31805—2015 豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofCowpeaseveremosaicvirus 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人:陈青、李彬、方志鹏、黄峰、廖富荣、陈红运、林石明。 ⅠGB/T31805—2015 豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了豇豆重花叶病毒检疫鉴定的血清学、生物学和分子检测方法。 本标准适用于可能携带有豇豆重花叶病毒的植物繁殖材料(种子、植株)和产品的检疫鉴定。 2 仪器设备和主要试剂 2.1 仪器设备 PCR仪、定量PCR仪、灭菌锅、制冰机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡震荡器、电泳仪、凝胶成像系 统、微量研磨仪、酶标仪、洗板机、微量天平(感量:0.001g)、水平电泳槽、高速冷冻台式离心机、水浴槽、 pH计、移液器(1000μL、200μL、20μL、2μL)、96孔酶标板、研钵等;防虫温室。 2.2 主要试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯。PCR缓冲液、dNTPs(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、DNA 聚合酶、引物和探针、琼脂,酶联检测试剂见附录B。 3 检测样品的制备 3.1 种子 挑取畸形种子播于灭菌土中,待长出3片~4片叶后,将表现症状的植株编号,未表现症状的植株 分组(10株为1组)并编号。采集的叶片分成2份,根据需要分别用于酶联测定和分子检测。 3.2 植株 有症状(如叶片畸形、花叶、斑驳等)的植株编号单独检测。没有症状的分组并编号检测,分组方法 和检测方法同3.1。双抗体夹心酶联免疫吸附测定。 4 检测与鉴定 4.1 双抗体夹心酶联免疫吸附测定 把制备的样品上清液加入已包被CPSMV抗体的酶联板中,进行DAS-ELISA。每个样品平行加到 两个孔中。设阴性对照和阳性对照[健康的植物组织作阴性对照,感染了CPSMV的植物组织作阳性对 照,其中阴性对照种类和材料(如种子或叶片)应尽量与检测样品一致],样品提取缓冲液作空白对照,不 同的检测试剂或试剂盒按说明操作。具体操作见附录B。 4.2 RT-PCR 分别提取样品和对照的总RNA,反转录合成cDNA后,进行PCR扩增。健康的植物组织作阴性对 照,感染CPSMV的植物组织作阳性对照,用超纯水作空白对照。具体操作见附录C。 1GB/T31805—2015 4.3 IC-RTReal-timePCR 分别提取样品和对照的总RNA,进行IC-RTreal-timePCR检测。健康的植物组织作阴性对照,感 染CPSMV的植物组织作阳性对照,超纯水作空白对照。具体操作见附录D。 4.4 生物学测定 样品按1∶2~1∶10(质量∶体积)加入研磨缓冲液,在研钵中研碎。研碎后放入硅藻土(浓度为 0.5%)并与病汁液混匀,接种到鉴别寄主上。具体操作参见附录E。 5 结果判断 样品经DAS-ELISA、普通RT-PCR或实时荧光RT-PCR检测结果为阴性时,判定样品未检出豇豆 重花叶病毒。 样品经DAS-ELISA检测结果为阳性,进一步用RT-PCR或实时荧光RT-PCR方法进行检测。 PCR结果为阴性,判定未检出豇豆重花叶病毒;PCR结果为阳性,可以判定为样品检出豇豆重花叶 病毒。 6 结果记录与样品保存 6.1 结果记录 完整的实验记录包括:样品的来源、种类、时间,实验的时间、地点、方法和结果等,并要有经手人和 实验人员的签字。酶联测定需有酶联板反应的原始数据;PCR检测需有电泳结果图片及序列测定分析 结果;实时荧光PCR需要有荧光曲线图与Ct值;生物学测定应有鉴别寄主的症状照片。结果记录与资 料保存期限至少1年。 6.2 样品保存 经检验确定携带CPSMV的样品应在合适条件下保存以备复核,种子保存在4℃,病叶冻干保存在 -20℃或者-80℃冰箱中,做好标记和登记工作。样品保存期限至少1年。 2GB/T31805—2015 附 录 A (资料性附录) 豇豆重花叶病毒相关资料 A.1 背景资料 A.1.1 豇豆重花叶病毒基本信息 学名:Cowpeaseveremosaicvirus 缩写:CPSMV 分类地位:豇豆花叶病毒属(Comovirus)成员。 A.1.2 方法原理 豇豆重花叶病毒的分子生物学特性、血清学特性和生物学特性是本标准制定的主要依据。 A.2 自然寄主 菜豆(Phaseolusvulgaris)、大豆(Glycinemax)、绿豆(Vignaradiata)、豇豆(Vignasinensis)、长 豇豆(Vignasesquipcdalis)、毛蔓豆(Calopogoniummucunoides),直生刀豆(Canavaliaensiformis), 距瓣豆(Centrosemapubescens),菽麻(Crotalariajuncea),Desmodiumcanescens,大翼豆 (Macroptiliumlathyroides),四棱豆(Psophocarpustetragonolobus),Crotalariapaulinea。 A.3 病害症状 几乎所有的寄主在接种叶上形成褪绿斑或坏死斑,系统症状为斑驳或花叶,幼叶通常形成明显疱状 突起、畸形。一些寄主表现系统坏死。 大豆:在巴西,受侵染的大豆出现植株矮化、芽枯、结荚数减少、产量降低; 毛蔓豆:出现严重花叶和疱状突起; 距瓣豆:出现褪绿和花叶症状; 菽麻:叶片出现褪绿斑驳和畸形或褪绿斑症状; 绿豆:叶片出现轻花叶和坏死斑症状; 豇豆:叶片出现褪绿花叶和严重畸形。 A.4 分布 美国、特立尼达(特立尼达和多巴哥共和国)、波多黎各岛、萨尔瓦多、哥斯达黎加、委内瑞拉、苏里 南、巴西、秘鲁、墨西哥。 A.5 传播途径 CPSMV可以通过机械传播,花粉、种子传播,豇豆的种传率为10%,长豇豆(Vignasesquipcdalis) 3GB/T31805—2015 的种传率为8%;也可以通过甲虫传播,主要是叶甲科甲虫传播,大约有10种,菜豆叶甲(Ceratomatri- furcata)是最重要的传播介体,还可以通过带斑黄瓜叶甲(Diabroticabalteata)和南美叶甲(D.spe- ciosa)、Cerotomaruficornis等媒介昆虫传播。 A.6 抗原特性 CPSMV具有强免疫原性,容易制备高滴度的特异抗体。 A.7 粒体形态 病毒粒体为等轴对称二十面体,直径25nm,无包膜。 A.8 基因组 CPSMV基因组由2条RNA组成,RNA-1和RNA-2由不同的病毒粒子包裹,RNA1包裹在沉降 组分B的粒子中,RNA2包裹在沉降组分M的粒子中。RNA-1长5957nt;RNA-2长3732nt。 4GB/T31805—2015 附 录 B (规范性附录) 双抗体夹心酶联免疫吸附测定 B.1 试剂 B.1.1 包被抗体 特异性的豇豆重花叶病毒抗体。 B.1.2 酶标抗体 碱性磷酸酯酶标记的豇豆重花叶病毒抗体。 B.1.3 底物溶液 对硝基苯磷酸二钠(pNPP)100mg溶解于底物缓冲液100mL中,现配现用。 B.1.4 样品抽提缓冲液 亚硫酸钠(Na2SO3) 1.3g 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(MW24000~40000)20.0g 叠氮化钠(NaN3) 0.2g 吐温20(tween-20) 20mL 溶于1L 1×PBST,调pH至7.4,4℃冰箱保存。 B.1.5 包被缓冲液 碳酸钠(Na2CO3) 1.59g 碳酸氢钠(NaHCO3) 2.93g 叠氮化钠(NaN3) 0.2g 溶于900mL蒸馏水,调pH至9.6,蒸馏水定容至1L,4℃冰箱保存。 B.1.6 PBST缓冲液(洗涤缓冲液) 氯化钠(NaCl) 8.0g 磷酸氢二钠(Na2HPO4) 1.15g 磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.2g 氯化钾(KCl) 0.2g 吐温20(Tween-20) 0.5mL 溶于900mL蒸馏水,调pH至7.4,蒸馏水定容至1L,4℃冰箱保存。 B.1.7 酶标抗体稀释缓冲液 牛血清白蛋白(BSA)或脱脂奶粉 2.0g 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(MW24000~40000)20.0g 叠氮化钠(NaN3) 0.2g 5GB/T31805—2015 溶于1L 1×PBST,调pH至7.4,4℃冰箱保存。 B.1.8 底物(pNPP)缓冲液 溶于800mL蒸馏水: 氯化镁(MgCl2) 0.1g 叠氮化钠(NaN3) 0.2g 二乙醇胺 97mL 溶于800mL蒸馏水中,用pH调至9.8,蒸馏水定容至1L,4℃冰箱保存。 B.2 实验步骤 B.2.1 包被抗体 用包被缓冲液将抗体按说明稀释,加入酶联板的孔中,100μL/孔,37℃孵育4h,清空孔中溶液, PBST洗涤3次。 B.2.2 样品制备 样品按1∶10(质量∶体积)加入抽提缓冲液,用研钵研磨成浆,7500g离心10min,上清液即为制 备好的待测样品。阴性对照、阳性对照作相